RT-PCR检测李坏死环斑病毒的研究

为了从植物组织中快速检测李坏死环斑病毒 (PNRSV) ,根据该病毒RNA 3序列设计引物 ,对感病和健康组织总RNA进行RT PCR ,结果从感病组织中扩增出了大约 45 0bp的目的片段 ,而健康组织中无此扩增带。将此PCR产物连接到 pGEM T easy载体 ,转化大肠杆菌DH5 5α菌株 ,得到了含有目的片段的重组子 ,并采用双脱氧终止法进行序列分析 ,结果与美国报道的李坏死环斑病毒RNA3序列对应部分核苷酸基本一致 (其同源性达 93.6 %) ,这表明应用RT PCR来检测李坏死环斑病毒是可行的 ;PCR产物克隆作为RT PCR反应的阳性对照解决了检疫对象不能扩散的问题 ,从而建立了RT

侵染月季的李坏死环斑病毒的检测及CP基因序列分析

Rose leaves with virus symptoms(mosaic,ring spot and line pattern) were detected by DAS-ELISA and RT-PCR.The results showed Prunus necrotic ring spot virus(PNRSV) infection in the leaves.CP gene of PNRSV isolated from Yunnan province was cloned and sequenced.Analysis of sequence showed that CP gene of PNRSV-yunnan contained 683 nucleotides encoding 165 aminoacids(EMBL accession number: AY684271).Nucleotide similarity of CP gene was more than 98% between PNRSV-yunnan and group I isolates,and less than 95% between PNRSV-yunnan and group II and III isolates.According to the results,PNRSV-yunnan was identified as a member of group I.

李坏死环斑病毒检测方法的比较研究

针对感染李坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)植株病毒的特异性检测,将DAS- ELISA、RT-PCR方法综合改进、优化,建立了免疫捕获反转录PCR(IC-RT-PCR)检测PNRSV的方法.该方法采用PNRSV抗体特异性免疫捕获病毒,并根据GenBank中PNRSV序列设计的特异性引物对PN5/PN3进行PCR扩增,得到约760 bp大小的特异性基因片段.扩增产物经克隆测序后,结果表明:产物序列与PNRSV的外壳蛋白编码基因存在94%～98%的同源性.检测广泛性以及灵敏度比较研究显示.IC-RT-PCR方法能从含量很低的受病样品中检出PNRSV,检测灵敏度与RT-PCR相近,但所检测样品的范围更广,适用于从植物各部位检测低含量的病毒.IC-RT-PCR检测灵敏度比DAS-ELISA方法高出1000倍.

侵染昆明玫瑰的李坏死环斑病毒的鉴定及其分子检测

采集昆明地区种植的花叶症状明显的玫瑰样品,运用现代分子生物学技术与常规技术相结合的方法,初步鉴定引起玫瑰花叶病的主要病毒病原为李坏死环斑病毒。该病毒引起玫瑰植株的系统花叶、畸形和皱缩等症状;电镜下病毒粒体为球形,直径为22～23nm;ELISA检测发现该病毒在植株芽、花粉和顶部叶片的浓度最高;同时,根据外壳蛋白的保守区利用Primer5.0设计该病毒的特异引物,对该病毒进行分子检测,得到450bp的预期DNA片断,并在此基础上,进行了巢式RT-PCR的分子检测,表明巢式RT-PCR的检测能力最强。并通过序列的同源性分析得知该病毒的外壳蛋白与已知PNRSV的同源性为98.0%,进一步证明了该病毒为李坏死环斑病毒。

用RT-PCR技术检测澳大利亚杏仁树李坏死环斑病毒

用RT-PCR技术检测澳大利亚杏仁树李坏死坏斑病毒,对92个待测样品的病毒RNA进行扩增和检测,其中有79个呈阳性,表明检验样品的染病率较高.RT-PCR技术检测病毒的方法灵敏、准确,是检测苗木是否感染病毒的有效方法之一.

用二重PCR方法检测李痘病毒和李坏死环斑病毒

以我国两种重要的检疫性木本植物病毒李痘病毒和李坏死环斑病毒为对象,研究了二重PCR的检测方法,为我国口岸对这两种病毒的检疫提供了一条更为灵敏有效的新方法。

李坏死环斑病毒诱导的桃PpPDS沉默体系的优化及验证

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是在桃(Prunus persica)上进行基因沉默的主要手段,现有VIGS体系效率较低,亟待开发针对桃的高效沉默体系。以桃八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase)基因PpPDS为指示基因,探究不同侵染方式、病毒载体、温度、接种苗龄和菌液浓度对桃叶片VIGS效率的影响。结果表明,在侵染方式上,叶片注射是有效的方式;李坏死环斑病毒(Prunus necrotic ring spot virus,PNRSV)载体(pCaRNA1/2和pCaRNA3)优于烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)改造后的TRV载体(pTRV1和pTRV2);温度为22℃左右PpPDS的沉默效率较高;苗龄为5~6片完全展开叶的桃苗沉默效率较高,达到85%;菌液浓度为OD600=1.0时沉默效率较高。以优化好的VIGS体系参数,选择桃叶绿素合成基因(PpGluTR和PpPOR)为目标基因进行验证,结果显示PpGluTR和PpPOR的表达均被显著抑制,叶片颜色变化明显。这些结果表明优化的VIGS体系稳定性好且沉默效率高,可用于桃基因功能的研究。

建立基于TaqMan探针的李坏死环斑病毒实时荧光RT-PCR检测方法

李坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)是世界部分范围内分布的有害生物,亦是我国重点关注的检疫对象。根据PNRSV各株系衣壳蛋白基因的保守序列,设计特异性引物和TaqMan荧光探针,进行了探针、引物和Mg2+浓度等反应体系和条件的优化实验,确定最佳的引物浓度为400 nmol/L、探针浓度为333 nmol/L、Mg2+离子浓度为5 mmol/L和dNTPs浓度为0.43 mmol/L时,其灵敏度达23个拷贝数。利用建立的实时荧光RT-PCR检测方法对PNRSV樱桃分离物进行了成功检测。这个方法具有灵敏、准确、简便、快速的特点,适合于李坏死环斑病毒的检测和鉴定。

3种核果类果树病毒多重PCR检测方法的建立与初步应用

根据李痘病毒(PPV)、李坏死环斑病毒(PNRSV)和李矮缩病毒(PDV)3种检疫性病毒的外壳蛋白基因保守序列设计特异性引物,在建立各种病毒单个RT-PCR技术的基础上,通过优化多重RT-PCR反应条件,初步建立了同步检测这3种病毒的多重RT-PCR检测体系。结果表明:3对引物特异性较强,分别可以扩增出172,675,945 bp的目的片段,该方法快速、灵敏、准确,为同时检测多种检疫性病毒提供了参考。

甜樱桃茎尖培养及PNRSV的RT-PCR检测

研究了茎尖大小、接种方式、培养基成分、试材基因型对甜樱桃品种茎尖培养的影响。 1年生成熟枝条上茎尖成苗率为 8.3%～ 2 3.7% ,嫩梢上的茎尖成苗率为 2 7.3%～ 37.5 %。利用RT PCR技术对部分甜樱桃试管苗进行了早期病毒鉴定 ,筛选出一些不带李坏死环斑病毒 (PNRSV)的甜樱桃试管苗 ,并证明甜樱桃试管苗微茎尖培养不能有效脱除PNRSV。