负载泼尼松龙牛奶外泌体治疗杜兴肌肉萎缩症的研究

目的:探究牛奶外泌体(mEXO)减少泼尼松龙(PSL)治疗杜兴肌肉萎缩症(DMD)的药物不良反应的效果。方法:将超速离心法收集的mEXO与PSL共孵育得到生物纳米药物(mEXO_(PSL));通过高效液相色谱(HPLC)检测药物装载效率;对DMD模型mdx小鼠给予口服治疗;监测mdx小鼠体重和体长变化,评估mEXO减轻PSL引起的生长抑制不良反应的效果,利用苏木素-伊红(HE)染色和micro-CT分析骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁间隙(Tb.Sp)等骨密度相关指标,评估mEXO减轻PSL引起的骨质疏松不良反应的效果;利用HE染色和CD68免疫组织化学染色检测肌肉病理情况及炎症浸润情况,评估mEXO_(PSL)的治疗效果。结果:通过共孵育可实现54.6%PSL在mEXO的负载;mdx小鼠经治疗后,与PSL组相比,mEXO_(PSL)组mdx小鼠体重(P<0.01)及体长(P<0.01)显著增加;与PSL组相比,mEXO_(PSL)组mdx小鼠的BV/TV(P<0.01)、Tb.N(P<0.01)和Tb.Th(P<0.05)显著增加,Tb.Sp(P<0.05)显著减少;与生理盐水组相比,PSL组和mEXO_(PSL)组肌肉病理以及炎症浸润均显著改善。结论:mEXO_(PSL)显著减少了mdx小鼠的生长抑制及骨质疏松药物不良反应,对PSL进行了药物改良。

2′-O-甲氧乙基反义寡核苷酸应用于杜兴肌肉萎缩症的体外研究

目的:通过对反义寡核苷酸2′-O-甲氧乙基(2′-O-MOE)化学结构的体外实验,为杜兴肌肉萎缩症基因治疗方法提供一种候选的反义寡核苷酸药物。方法:在杜兴肌肉萎缩症小鼠H2K mdx细胞上转染不同长度和骨架修饰的2′-O-MOE反义寡核苷酸,利用RT-PCR技术检测其诱导外显子跳读的情况。结果:3种2′-O-MOE修饰的反义寡核苷酸体外诱导外显子跳读的效率显著高于目前临床检测的药物2′OmePS,表现出一定的浓度效应和时间效应。并且MOE25(PS)诱导外显子跳读的效率最好。结论:2′-O-MOE修饰的反义寡核苷酸能够有效地诱导H2K mdx细胞外显子跳读。

己糖对杜兴肌肉萎缩症核酸药物Pip5e-PMO跳读活性研究

目的:在杜兴肌肉萎缩症模型上探究己糖混合物对核酸药物Pip5e-PMO介导的外显子跳读活性的促进作用。方法:选择成年mdx小鼠为测试动物模型,通过局部肌肉和系统尾静脉注射,比较Pip5e-PMO与己糖和生理盐水联用的作用效果,利用免疫荧光(IHC)和蛋白印迹法(Western blot)检测dystrophin阳性肌纤维的数量和分布及dystrophin蛋白的表达水平;利用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测外显子跳读。结果:在局部肌肉给药试验中,己糖能够促进Pip5e-PMO诱导dystrophin蛋白表达水平(P<0.05)。在系统试验中,对己糖和生理盐水组比较发现:按15 mg/kg的剂量单次系统尾静脉注射Pip5e-PMO,骨骼肌中dystrophin蛋白表达恢复至正常水平的50%;在心脏中,也检测到明显的dystrophin恢复表达和外显子跳读。但两组无显著性差别(P>0.05)。结论: Pip5e-PMO可诱导有效的外显子跳读和dystrophin蛋白表达,但己糖对其促进效果有限。

B族维生素对肌肉萎缩小鼠PMO运输效率的影响

目的:探究B族维生素对反义寡核苷酸药物磷酸二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)在DMD治疗中运输效率的影响以及药物安全性评价。方法:通过对成年的杜兴肌肉萎缩症(DMD)模型mdx小鼠胫骨前肌分别局部注射PMO和各种维生素的混合液,利用免疫荧光(IF)和Western印迹检测dystrophin蛋白表达情况,评估各维生素对PMO作用效果的影响;通过尾静脉注射PMO和维生素B12的混合液,相同方法检测维生素B12对PMO治疗效果的影响,同时利用苏木素-伊红组织染色(HE)技术检测组织病理情况,评估维生素B12联合PMO治疗的安全性。结果:在mdx小鼠局部给药实验中,比较不同的B族维生素对PMO药效影响时,发现维生素B12对PMO的促进效果最佳(t=8.015,P<0.01);随后选择维生素B12与PMO混合对mdx小鼠进行系统治疗时,相比于PMO生理盐水组,发现维生素B12能够在胫骨前肌(t=9.631,P<0.01)和股四头肌(t=8.452,P<0.01)上明显提高PMO的系统治疗效果,同时对mdx小鼠不产生肌肉不良反应。结论:维生素B12作为营养补充剂能够显著提高PMO在mdx小鼠上的局部治疗效果,但系统治疗效果有限,且对小鼠肌肉组织无损伤。

心肌靶向肽的筛选及验证

目的 利用噬菌体展示技术,在心肌活体切片上筛选能特异性结合心肌的靶向短肽,提高药物心肌组织靶向运输效率,为杜兴肌肉萎缩症（DMD）及其他心肌相关疾病的靶向治疗提供有效的候选靶向肽.方法 制备心肌活体切片,体外培养心肌活体切片并用免疫组化技术检测其蛋白活性.将噬菌体文库以1x1012pfu的滴度与体外培养的心肌活体切片共孵育,回收并扩增与心肌活体切片结合的噬菌体,再经5轮体外生物淘选获得特异性靶向心肌的噬菌体,测序分析候选噬菌体的插入序列并对高效富集的噬菌体进行体内组织分布验证.结果 成功建立了心肌活体切片体外培养平台,获得了具有良好生物学活性的心肌活体切片,活体切片培养48 h后,仍能检测到抗肌萎缩蛋白的正常表达和定位.在此基础上,利用噬菌体文库对心肌活体切片进行5轮筛选,回收滴度测定结果显示淘选具有良好的富集效应.筛选后的噬菌体测序分析和体内组织分布验证结果显示,候选噬菌体在心肌、骨骼肌中出现明显富集,而在肝、肾组织中分布显著降低.结论 筛选出的候选噬菌体在心肌和骨骼肌中均表现为较高的结合效率,证明候选短肽具有心肌靶向能力,同时也为DMD的心肌靶向治疗提供了一种新方法.