荒漠型杜氏利什曼原虫虫株在体内外的致病力及保存方法研究

目的通过动物攻毒实验观察荒漠型杜氏利什曼原虫虫株在动物体内外的致病力,探索保持该虫株致病力的保存方法。方法将从rK39抗体阳性灰仓鼠脾脏中分离获得的荒漠型杜氏利什曼原虫虫株分别在体外培养基中传代培养至7 d、30 d、36 d、44 d、60 d、90 d和150 d后,按2.6×10^(5)条/只剂量腹腔接种至草原兔尾鼠,接种后60 d计算动物的脾脏系数、虫株感染率和抗体阳性率。进一步将荒漠型杜氏利什曼原虫虫株分别接种灰仓鼠和草原兔尾鼠进行传代保种,比较两种动物感染该虫株后的存活时间和致病力变化。结果体外培养7~150 d的荒漠型杜氏利什曼原虫虫株接种后,草原兔尾鼠的脾脏系数由7 d的1.0%上升至30 d的2.2%,达到正常脾脏系数(0.15%)的10倍以上,而60 d的脾脏系数虽有下降,但仍然达正常值的3倍;虫株感染率和抗体阳性率由7 d的80%逐步下降至60 d的0%;90 d时的各项观测指标与对照组相比无明显差异,均在正常值范围内。传代感染虫株后,草原兔尾鼠的存活时间为1~13个月,感染的半数个体于接种后4个月内死亡;而灰仓鼠的存活时间为5~31个月,感染的半数个体于接种后13.7个月内死亡;两种动物的平均死亡时间差异显著(t=0.0001,P<0.001),脾脏系数差异无统计学意义(t=0.990,P>0.05)。该虫株在两种动物体内的致病力一致,且在动物体内连续传代4年仍然具有致病力。结论荒漠型杜氏利什曼原虫虫株随体外培养时间延长,其致病力逐步降低,90 d时对草原兔尾鼠已无致病力,说明培养基传代培养方法不能保持该虫株对动物的致病力。动物体内传代接种才可以保持该虫株对动物的致病力。

杜氏利什曼原虫cDNA文库的构建

目的 :建立杜氏利什曼原虫 c DNA文库 ,以获取个体基因表达产物和研究基因结构。方法 :以杜氏利什曼原虫四川人分离株 m RNA为模板 ,体外合成 c DNA,以噬菌体λgt11DNA为载体构建文库。结果 :共获 2× 10 6重组子 ,插入比例为 4 8%。文库经抗杜氏利什曼原虫前鞭毛体全虫兔抗血清筛选 ,共筛 2× 10 4重组子 ,获 3个阳性表达克隆 ,表达产物的分子量分别为 :136k Da、160 k Da和 148k Da。结论 :已构建成的表达型杜氏利什曼原虫 c DNA文库 ,其插入比例和表达效率均较高。

杜氏利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体的比较蛋白质组学分析

目的应用蛋白质组学技术分析杜氏利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体蛋白质表达状况。方法分别提取和纯化杜氏利什曼原虫四川SC6株前鞭毛体与纯培养无鞭毛体的总蛋白,分别经pH3～10的预制胶条进行双向电泳分离,凝胶用考马斯亮蓝染色,凝胶图像以PDQuest1.0软件分析,并对主要差异表达蛋白点用电喷雾质谱法进行鉴定。结果等量的前鞭毛体与纯培养的无鞭毛体总蛋白经双向电泳分离后均可获近700个蛋白点,其中超过90%的蛋白点的分布和相对强度基本一致。与前鞭毛体比较,6个蛋白点在无鞭毛体蛋白中明显高表达,3个蛋白点低表达。6个明显高表达的蛋白点中有5个为已知功能蛋白,分别为Reiske铁硫蛋白前体、α微管蛋白、过氧化物酶1、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶前体和甘露糖-1-磷酸瓜氨酸转移酶;3个低表达的蛋白点中有2个为已知功能蛋白,分别为热休克蛋白70和β微管蛋白。这些差异调节表达蛋白与碳水化合物/能量代谢,应激反应,细胞膜和细胞骨架形成相关。结论前鞭毛体与无鞭毛体蛋白质的表达存在差异。

杜氏利什曼原虫热休克蛋白70的DNA疫苗表达载体构建及体内应答研究

以多聚酶链反应技术扩增获得了杜氏利什曼原虫（Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ）热休克蛋白７０（ＨＳＰ７０）全长基因序列，构建ＤＮＡ疫苗表达载体ｐＶＲ１０２０－ＨＳＰ７０。以脂质体法体外转染小鼠成纤维细胞系ＳＶＴ２，应用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法证实构建的表达载体具有表达ＨＳＰ７０的能力。以１０μｇ的ＤＮＡ疫苗表达载体质粒经肌肉、皮下注射进行免疫，２周后即可出现抗－ＨＳＰ７０的抗体应答。建立了ＤＮＡ疫苗免疫应答的模型。

杜氏利什曼原虫平原和荒漠疫区分离株LACK基因克隆及序列分析

目的 测定我国平原疫区和荒漠疫区杜氏利什曼原虫分离株活性蛋白激酶 C受体同源物 (L ACK)基因序列 ,并与山丘疫区分离株及国外利什曼原虫分离株进行比较。 方法 应用 RT- PCR扩增 L ACK基因 ,将其克隆入p UC18载体后用双脱氧链末端终止法测序 ,并与 Gen Bank中相关数据进行比较。 结果 用 RT- PCR成功扩增出约95 0 bp的 L ACK基因片段 ,测序结果表明其片段大小均为 94 2 bp,与 Gen Bank中多种利什曼原虫 L ACK基因的核苷酸序列一致性达 97%以上。我国山丘、平原和荒漠 3个不同疫区杜氏利什曼原虫分离株的 L ACK基因序列的一致性达95 %以上。 结论 获得了我国平原和荒漠疫区杜氏利什曼原虫 L ACK基因序列。我国 3个不同疫区杜氏利什曼原虫分离株的 L ACK基因具有高度同源性。

杜氏利什曼原虫蛋白磷酸酶-2C的基因克隆化与序列分析

目的 克隆杜氏利什曼原虫 (Leishmaniadonovani,Ld) 1S株蛋白磷酸酶 2C(PP2C)的编码基因 ,为应用这种编码T细胞抗原的基因进行基因疫苗研究奠定基础。方法 体外培养杜氏利什曼原虫 1S株无鞭毛体 ,常规方法从虫体提取制备基因组DNA。以夏科氏利什曼原虫 (Leishmaniachagasi,Lc)的PP2C基因序列为参照 ,设计并合成利什曼原虫PP2C基因序列特异性的引物。结果 以杜氏利什曼原虫的基因组为模板 ,利用多聚酶链反应 (PCR)技术 ,扩增获得了杜氏利什曼原虫PP2C的全长编码基因。基因序列测定结果表明 ,杜氏利什曼原虫 1S株PP2C基因序列长度为 1317bp ,开放读码框架由 12 2 1bp组成 ,编码产物为 40 6个氨基酸残基。获得的杜氏利什曼原虫 1S株的PP2C基因与来源于夏科氏利什曼原虫的PP2C氨基酸残基序列的同源性为 95 % (387/ 40 6 )。结论 本研究克隆了杜氏利什曼原虫的PP2C基因 。

雄性激素对小鼠骨髓巨噬细胞杜氏利什曼原虫感染水平的影响(英文)

目的：研究雄性激素对杜氏利什曼原虫感染的Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠骨髓巨噬细胞（ＢＭＭｓ）水平的影响。方法：用雄性激素处理小鼠３ｗｋ后，收集ＢＭＭｓ，培养５ｄ后，按ＢＭＭｓ前鞭毛体＝１１０的比例，接种杜氏利什曼原虫，用吉姬氏染色法观察不同时相的感染水平。结果：与植物油处理的对照组相比，雄性激素处理的小鼠ＢＭＭｓ对前鞭毛体较为易感，并随着感染时间的延长其感染水平增高（感染后３ｈ，Ｐ＜０．０５；２４ｈ，４８ｈ和７２ｈ，Ｐ＜０．０１）。结论：雄性激素可增加杜氏利什曼原虫对ＢＭＭｓ的感染水平。

山丘疫区杜氏利什曼原虫核糖体基因内转录间隔区的克隆及序列分析

目的 构建我国山丘疫区杜氏利什曼原虫分离株前鞭体核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区 (ITS)片段克隆 ,并进行测序及同源性分析。 方法 提取杜氏利什曼原虫前鞭毛体DNA进行PCR扩增 ,将扩增出rDNAITS片段克隆入pMD18 Tvector上 ,双脱氧链末端终止法测序。 结果 扩增出约 10 0 0bp的rDNAITS片段。测序结果表明山丘疫区的2株利什曼原虫L .d .SC10和L .d .6分别为 10 2 7bp和 10 2 8bp。序列分析结果表明 ,L .d .SC10和L .d .6有一定差异。 结论 获得了我国山丘疫区杜氏利什曼原虫分离株L .d .SC10和L .d .6的前鞭体rDNAITS序列。

杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因重组质粒的免疫原性研究

目的研究杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因重组质粒pcDNA3.1-amastin的免疫原性。方法将18只雌性BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,每组9只。两组分别肌肉注射重组质粒pcDNA3.1-amastin和空质粒pcDNA3.1(+)(50μg/只),2周后同法加强免疫1次。加强免疫后第7、14和21天每组各取小鼠3只,内眦采血,分离血清,间接ELISA法测定血清中抗原特异性抗体水平。随后脱颈处死小鼠,无菌取脾,分离脾细胞,用刀豆球蛋白A刺激培养,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测脾淋巴细胞增殖活性和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性。双抗体夹心ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)和IL-4的水平。结果加强免疫后第7、14和21天,实验组均检测到特异性IgG抗体,效价在1∶640以上,而对照组未检测到IgG抗体(P<0.01);实验组脾淋巴细胞增殖活性刺激指数分别为4.28±0.51、5.01±0.60和4.39±0.50,均高于对照组(P<0.01);实验组脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ含量分别为(42.06±4.26)、(66.02±6.02)和(58.29±3.75)pg/ml,IL-2含量分别为(38.21±5.11)、(64.79±8.67)和(52.69±7.15)pg/ml,均高于对照组(P<0.01),两组均未检测到IL-4;实验组脾淋巴细胞CTL杀伤活性分别为(42.20±5.96)%、(63.66±5.44)%和(52.24±4.56)%,均高于对照组(P<0.01)。结论杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因重组质粒pcDNA3.1-amastin免疫小鼠后可诱导其产生特异的体液免疫应答和Th1型细胞免疫应答。

杜氏利什曼原虫四川分离株无鞭毛体蛋白基因的克隆及真核表达

目的克隆、真核表达杜氏利什曼原虫四川株的无鞭毛体蛋白(amastin)编码基因。方法PCR扩增杜氏利什曼原虫四川汶川人株L．d．SC10H2与四川南坪犬株L．d．SC7的无鞭毛体蛋白基因,将该基因导入pcDNA3．1(+),构建真核表达重组质牲,转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法鉴定重组质粒的瞬时表达;RT-PCR和Western blotting鉴定稳定表达,结果2株杜氏利什曼原虫均扩增出552 bp的无鞭毛体蛋白基因。同源性为86％。转染后在NIH3T3细胞膜和细胞内观察到较强的绿色荧光,表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞中获得短暂表达。细胞裂解产物经Western blotting,在相对分子质量(Mr)约20000处检测到阳性杂交信号,表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞内获得了稳定表达。结论获得了我国杜氏利什曼原虫四川分离株L．d．SC10H2和L．d．SC7的无鞭毛体蛋白基因序列,并在NIH3T3细胞中稳定表达。

杜氏利什曼原虫遗传转化中潮霉素及嘌呤霉素适宜浓度的筛选

通过基因打靶构建基因缺失株是利什曼原虫分子水平研究的有效方法,而筛选特定的转化体是研究成功的第1步。筛选转化体常用抗生素筛选法。本文通过观察潮霉素和嘌呤霉素不同质量浓度对杜氏利什曼原虫四川分离株的生长抑制情况,确定了在抗性基因转化的阳性克隆筛选中,潮霉素及嘌呤霉素的适宜筛选浓度分别为32和10μg/mL。本实验的结果为下一步筛选杜氏利什曼原虫基因缺失株提供了可靠的实验依据。

杜氏利什曼原虫amastin基因重组真核表达质粒的构建与表达

目的:构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白(amas-tin)编码基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin,并研究其在NIH3T3细胞中的表达。方法:提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增。将扩增的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒pcDNA3.1(+)中,构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。以pcDNA3.1-amastin转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光染色法和RT-PCR分别鉴定pcDNA3.1-amastin的瞬时表达和稳定表达。结果:在细胞膜和细胞内均观察到较强的绿色荧光,表明pcDNA3.1-amastin成功地转入NIH3T3细胞,并在细胞膜和细胞内获得短暂表达。稳定转染的NIH3T3细胞的总RNA经反转录后,用PCR扩增出无鞭毛体蛋白基因,表明获得了稳定表达。结论:成功地构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因的真核表达重组质粒,并且该基因在NIH3T3细胞中获得了稳定表达。

我国不同疫区杜氏利什曼原虫ITS片段的克隆及序列分析

为测定我国荒漠、山丘、平原疫区杜氏利什曼原虫分离株ITS序列并分析其序列差异,首先提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增,然后将扩增出ITS片段克隆入PMD18-Tvector上,再用双脱氧链末端终止法测序。结果用PCR成功扩增出约1000bp的ITS片段,测序结果表明:本文报道的荒漠、山丘、平原疫区的3株杜氏利什曼原虫(L.dXJ771,L.dSC10,L.dSD2)的ITS序列大小分别为:1086、1027、1028bp。序列分析表明:我国杜氏利什曼原虫荒漠分离株(L.dXJ771)的ITS序列与平原分离株(L.dSD2)及山丘分离株(L.dSC10)的ITS序列有明显差异,平原分离株(L.dSD2)与山丘分离株(L.dSC10)的ITS序列也存在较明显差异,荒漠分离株(L.dXJ771)与山丘分离株(L.dSC10)的ITS序列差异略小于与平原分离株(L.dSD2)的ITS序列差异。

杜氏利什曼原虫 23 kDa抗原编码基因克隆的表达

将已建立的杜氏利什曼原虫 c DNA文库基因 ,亚克隆于 p UC18质粒载体 ,诱导表达筛选两个克隆 ,即 P1、P2 ,表达的蛋白分子量皆为 2 3k Da,P1克隆表达的 2 3k Da蛋白分子 ,经 Western blot分析显示 。

抗杜氏利什曼原虫犬分离株单克隆抗体的研制及用于病犬血清循环抗原的检测

本文报道用杜氏利什曼原虫大分离株前鞭毛体膜抗原免疫BALB/c小鼠的脾细胞与Sp2/0瘤细胞融合,得到多株分泌抗体较高且稳定的细胞株。进一步筛选出McAb C11-G10-A4可用于检测病犬血清循环抗原。用McAb-AST检测采自甘肃省黑热病流行区的30份犬血清,阳性率30％。与骨髓涂片查病原体的总符合率为86.7％,阳性符合率达100％。69份非流行区对照大血清检测结果,仅1份出现阳性反应,可见本试验的敏感性较高,特异性较强(98.55％)。

杜氏利什曼原虫SSU rRNA逆转录多聚酶链反应的建立

我们采用引物Ｒ２２２和Ｒ３３３建立杜氏利什曼原虫ＳＳＵｒＲＮＡ逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）。采用ＳｉＯ２－高盐吸附法同时抽提杜氏利什曼原虫ＲＮＡ和ＤＮＡ，分别用ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ进行扩增，结果显示以ＲＮＡ为检测对象的ＲＴ－ＰＣＲ肉眼可见区带的检测水平较ＬＪＤＮＡ为检测对象的ＰＣＲ扩增高１００倍，可见ＲＴ－ＰＣＲ具有敏感性高、特异性强的特点。

用流式细胞术分析双氢青蒿素对杜氏利什曼原虫DNA的作用

应用流式细胞术（ Ｆ Ｃ Ｍ ）检测分析了双氢青蒿素对杜氏利什曼原虫前鞭毛体 Ｄ Ｎ Ａ 的作用。４ 个不同浓度（１７７×１０－ ４，３５３×１０－ ４，７１×１０－ ４，１４１×１０４ｍ ｏｌ／ Ｌ）的药物对虫体 Ｄ Ｎ Ａ 均有抑制作用，用药组虫体 Ｄ Ｎ Ａ 含量的荧光分布随着药物浓度的升高而减弱，抑制率分别为 ３２３％ ，３２６％ ，８６４％ ，８９２％ ，与对照组相比有显著性差异（ Ｐ＜ ００５）。后两个用药组与前两个用药组抑制率有显著性差异（ Ｐ＜ ０００５）。本研究结果与光镜观察、３ Ｈ Ｔｄ Ｒ

重组杜氏利什曼原虫39kD抗原的诊断价值

为了给内脏利什曼病（ＶＬ）患者提供较为准确的实验诊断方法。我们将表达杜氏利什曼原虫３９ｋＤ抗原的大肠杆菌制备物进行电泳并转移至硝酸纤维滤膜上，以１１例确诊ＶＬ病人的不同稀释度血清对其识别，当稀释度达１∶４００时，全部病人血清均能明显识别３９ｋＤ抗原带．而正常人血清和其他病人血清不识别３９ｋＤ抗原带，说明重组杜氏利什曼原虫３９ｋＤ抗原具有一定的诊断价值，用其检测病人血清中相应抗体可以诊断内脏利什曼病。

海藻酸钠两性霉素B对杜氏利什曼原虫前鞭毛体作用体外实验研究

目的 治疗犬利什曼病 ,消灭保虫宿主 ,达到预防黑热病的目的。方法 观察海藻酸钠两性霉素B在不同浓度对杜氏利什曼原虫 (L d)江苏株及L d四川人株前鞭毛体的体外作用。采用显微镜下观察试验。结果 实验组 3个不同浓度 ( 10 μg/ml、 5 μg/ml、 12 μg/ml)的药物作用 48h后 ,培养基颜色未变 (红 ) ,虫体活动变慢 ,虫数减少 ,抑制率升高 (L d江苏株的抑制率由 70 %升至 93% ,L d四川人株由 82 %升至 96 % )。染色后见虫体变形 ,核、动基体不完整 ,胞质内出现多个空泡 ,鞭毛脱落。对照组的培养基颜色变黄 ,虫体运动活跃 ,大部分呈长梭形 ,并排成菊花状。染色后虫体呈长梭形 ,核、动基体、胞膜及鞭毛完整、清晰。结论 海藻酸钠两性霉素B对杜氏利什曼原虫有较强的体外抑制作用。