杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因重组质粒的免疫原性研究

目的研究杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因重组质粒pcDNA3.1-amastin的免疫原性。方法将18只雌性BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,每组9只。两组分别肌肉注射重组质粒pcDNA3.1-amastin和空质粒pcDNA3.1(+)(50μg/只),2周后同法加强免疫1次。加强免疫后第7、14和21天每组各取小鼠3只,内眦采血,分离血清,间接ELISA法测定血清中抗原特异性抗体水平。随后脱颈处死小鼠,无菌取脾,分离脾细胞,用刀豆球蛋白A刺激培养,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测脾淋巴细胞增殖活性和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性。双抗体夹心ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)和IL-4的水平。结果加强免疫后第7、14和21天,实验组均检测到特异性IgG抗体,效价在1∶640以上,而对照组未检测到IgG抗体(P<0.01);实验组脾淋巴细胞增殖活性刺激指数分别为4.28±0.51、5.01±0.60和4.39±0.50,均高于对照组(P<0.01);实验组脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ含量分别为(42.06±4.26)、(66.02±6.02)和(58.29±3.75)pg/ml,IL-2含量分别为(38.21±5.11)、(64.79±8.67)和(52.69±7.15)pg/ml,均高于对照组(P<0.01),两组均未检测到IL-4;实验组脾淋巴细胞CTL杀伤活性分别为(42.20±5.96)%、(63.66±5.44)%和(52.24±4.56)%,均高于对照组(P<0.01)。结论杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因重组质粒pcDNA3.1-amastin免疫小鼠后可诱导其产生特异的体液免疫应答和Th1型细胞免疫应答。

杜氏利什曼原虫无鞭毛体形态及分裂过程的电镜观察

无鞭毛体呈椭圆形,后部有深杯样表膜凹陷,虫体一侧有一小突起。膜下微管数为74—90个。细胞核有1—3个核仁,细胞质内充满核糖体,动基体大小不一,多呈腊肠形,由动基体延伸形成长袋状线粒体。靠近鞭毛袋一侧有一组4个游离微管,鞭毛轴丝为9+2结构,并具有基板_1和基板_2结构,基体为9组三联微管。 无鞭毛体分裂从新鞭毛轴丝形成和动基体DNA纤丝伸长开始,以后DNA纤丝带出现裂隙,继之核仁裂碎、消失,形成核内纺锤体,开始细胞核的分裂,随后虫体一侧表膜出现凹陷,新膜下微管和表膜先后形成,并从此处向细胞内伸入,最后完全包绕两个分裂的虫体,完成细胞分裂。随着虫体的发育繁殖,含虫空泡涨大,电子致密度变低。分裂后的无鞭毛体贴附到含虫空泡膜,并向巨噬细胞细胞质内移动,最后离开原来的含虫空泡,形成新的含虫空泡。

杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因原核表达重组质粒的构建

目的:构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白(amastin)编码基因的原核表达重组质粒pET-amastin。方法:提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增,将扩增出的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒载体pET-32a(+),构建原核表达重组质粒pET-amastin。结果:扩增出大小约550 bp的无鞭毛体蛋白基因,重组质粒pET-amastin经鉴定正确。结论:成功构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因原核表达重组质粒pET-amastin。

杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因真核表达重组质粒构建

目的构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白(amastin)编码基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。方法提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增,将扩增出的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒载体pcDNA3.1(+),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。结果扩增出大小约550bp的无鞭毛体蛋白基因;重组质粒pcDNA3.1-amastin经鉴定正确。结论成功构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。

杜氏利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体的比较蛋白质组学分析

目的应用蛋白质组学技术分析杜氏利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体蛋白质表达状况。方法分别提取和纯化杜氏利什曼原虫四川SC6株前鞭毛体与纯培养无鞭毛体的总蛋白,分别经pH3～10的预制胶条进行双向电泳分离,凝胶用考马斯亮蓝染色,凝胶图像以PDQuest1.0软件分析,并对主要差异表达蛋白点用电喷雾质谱法进行鉴定。结果等量的前鞭毛体与纯培养的无鞭毛体总蛋白经双向电泳分离后均可获近700个蛋白点,其中超过90%的蛋白点的分布和相对强度基本一致。与前鞭毛体比较,6个蛋白点在无鞭毛体蛋白中明显高表达,3个蛋白点低表达。6个明显高表达的蛋白点中有5个为已知功能蛋白,分别为Reiske铁硫蛋白前体、α微管蛋白、过氧化物酶1、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶前体和甘露糖-1-磷酸瓜氨酸转移酶;3个低表达的蛋白点中有2个为已知功能蛋白,分别为热休克蛋白70和β微管蛋白。这些差异调节表达蛋白与碳水化合物/能量代谢,应激反应,细胞膜和细胞骨架形成相关。结论前鞭毛体与无鞭毛体蛋白质的表达存在差异。

双氢青蒿素对杜氏利什曼原虫前鞭毛体作用体外实验研究

观察双氢青蒿素在不同浓度、不同时间对杜氏利什曼原虫（Ｌ．ｄ）汶川株及Ｌ．ｄ山东株前鞭毛体的体外作用。采用镜下观察及胸腺嘧啶核苷（３Ｈ－ＴｄＲ）掺入试验。结果：（１）镜下观察：实验组３个不同浓度（１４．１×１０－４ｍｏｌ／Ｌ、７．１×１０－４ｍｏｌ／Ｌ、３．５３×１０－４ｍｏｌ／Ｌ）的药物作用４８ｈ后，培养基颜色未变（红），虫体活动变慢以至几乎不动，虫数减少，抑制率升高（Ｌ．ｄ汶川株的抑制率由７３％升至８６％，Ｌ．ｄ山东株由６９．４％升至９７．５％），染色后见虫体变形，核、动基体不完整，胞质内出现多个空泡，鞭毛脱落。对照组的培养基颜色变黄，虫体活跃，大部分呈长梭形，并排成菊花状。染色后虫体呈长梭形，核、动基体、鞭毛、胞膜完整、清晰。（２）３Ｈ－ＴｄＲ掺入试验：双氢青蒿素在３．５３×１０－４ｍｏｌ／Ｌ２４ｈ即对两株有抑制作用（Ｌ．ｄ汶川株抑制率６５．８％，山东株为９３．４％）。但随着药物浓度的升高，作用时间的延长，抑制作用没有明显变化（Ｐ＞０．０５）。对Ｌ．ｄ山东株的抑制作用较Ｌ．ｄ汶川株为强。本文为首次报道双氢青蒿素对杜氏利什曼原虫具有较强的体外抑制作用。

杜氏利什曼原虫四川分离株无鞭毛体蛋白基因的克隆及真核表达

目的克隆、真核表达杜氏利什曼原虫四川株的无鞭毛体蛋白(amastin)编码基因。方法PCR扩增杜氏利什曼原虫四川汶川人株L．d．SC10H2与四川南坪犬株L．d．SC7的无鞭毛体蛋白基因,将该基因导入pcDNA3．1(+),构建真核表达重组质牲,转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法鉴定重组质粒的瞬时表达;RT-PCR和Western blotting鉴定稳定表达,结果2株杜氏利什曼原虫均扩增出552 bp的无鞭毛体蛋白基因。同源性为86％。转染后在NIH3T3细胞膜和细胞内观察到较强的绿色荧光,表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞中获得短暂表达。细胞裂解产物经Western blotting,在相对分子质量(Mr)约20000处检测到阳性杂交信号,表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞内获得了稳定表达。结论获得了我国杜氏利什曼原虫四川分离株L．d．SC10H2和L．d．SC7的无鞭毛体蛋白基因序列,并在NIH3T3细胞中稳定表达。

杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白N端胞外区基因(ast1)的克隆及表达

构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白N端胞外区基因(ast1)的原核表达重组质粒pET32a(+)-ast1,并在大肠杆菌BL21中进行表达。从杜氏利什曼原虫基因组DNA中扩增无鞭毛体蛋白基因并用SOSUI和Tmpred方法预测其跨膜区结构;根据跨膜区预测的结果,扩增基因ast1并将其连接到原核表达载体pET32a(+)中,重组质粒命名为pET32a(+)-ast1,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。SDS-PAGE和免疫印迹分析表明,在约27kDa处获得重组目的蛋白rAST1的表达,显示成功构建杜氏利什曼原虫原核表达重组质粒pET32a(+)-ast1,并在大肠杆菌BL21中获得有效表达。

海藻酸钠两性霉素B对杜氏利什曼原虫前鞭毛体作用体外实验研究

目的 治疗犬利什曼病 ,消灭保虫宿主 ,达到预防黑热病的目的。方法 观察海藻酸钠两性霉素B在不同浓度对杜氏利什曼原虫 (L d)江苏株及L d四川人株前鞭毛体的体外作用。采用显微镜下观察试验。结果 实验组 3个不同浓度 ( 10 μg/ml、 5 μg/ml、 12 μg/ml)的药物作用 48h后 ,培养基颜色未变 (红 ) ,虫体活动变慢 ,虫数减少 ,抑制率升高 (L d江苏株的抑制率由 70 %升至 93% ,L d四川人株由 82 %升至 96 % )。染色后见虫体变形 ,核、动基体不完整 ,胞质内出现多个空泡 ,鞭毛脱落。对照组的培养基颜色变黄 ,虫体运动活跃 ,大部分呈长梭形 ,并排成菊花状。染色后虫体呈长梭形 ,核、动基体、胞膜及鞭毛完整、清晰。结论 海藻酸钠两性霉素B对杜氏利什曼原虫有较强的体外抑制作用。

体外培养杜氏利什曼原虫无鞭毛期和期特异性抗原的测定

利什曼原虫无鞭毛期主要寄生在人体内巨噬细胞和网状内皮系统的其它吞噬细胞内。通常,媒介体内的前鞭毛体可经体外培养获得,而对无鞭毛期原虫的体外培养研究自1979年以来曾有不少学者用kuffer′s细胞、皮肤粘膜细胞、骨髓细胞及人外周血液等方法,均只能在较短时间获得成功。国内对无鞭毛期的体外培养,迄今尚无报道。为此,我们对其培养方法进行了研究,并以获得的材料,对杜氏利什曼原虫无鞭毛期的相关抗原作了观察。

硕大利什曼原虫无鞭毛体蛋白的基因克隆与序列分析

[目的 ]克隆硕大利什曼原虫无鞭毛体蛋白 (amastin)的编码基因序列。 [方法 ]应用核苷酸序列数据库 (GenBank)和表达序列末端片段数据库 (dbEST)的计算机检索与DNA文库的杂交筛选方法。 [结果 ]从dbEST数据库中获得一段 30 9nt的来源于硕大利什曼原虫的基因片段 ,据此设计探针 ,筛选硕大利什曼原虫的DNA文库 ,获得硕大利什曼原虫无鞭毛体蛋白的编码基因。其开放读码框架由 5 5 2个核苷酸组成 ,编码产物由183个氨基酸残基组成。序列分析表明 ,硕大利什曼原虫与锥虫无鞭毛体蛋白一级结构的同源性为 2 3 5 %。 [结论 ]克隆的基因系硕大利什曼原虫表面蛋白编码基因 ,即无鞭毛体蛋白的编码基因。

墨西哥利什曼原虫无鞭毛体蛋白的基因克隆化与序列分析

目的克隆墨西哥利什曼原虫（L．mex）WR972株的无鞭毛体蛋白（amastin）的编码基因，并对其同源核苷酸序列进行分析。方法根据已克隆的亚马逊利什曼原虫无鞭毛体蛋白的编码基因序列，设计并合成无鞭毛体蛋白基因特异性引物，以墨西哥利什曼原虫WR972株的基因组DNA作为模板，进行多聚酶链反应（PCR）扩增。将扩增的DNA片段克隆到pCR2．1T载体中，进行测序，并对同源的核苷酸序列分析、比较。结果从体外培养的墨西哥利什曼原虫WR972株提取基因组DNA，以无鞭毛体蛋白基因特异性引物进行PCR扩增获得550bp的DNA片段。克隆到pCE2．1T载体片段进行的序列测定结果表明，获得了墨西哥利什曼原虫的无鞭毛体蛋白编码基因片段，与亚马逊利什曼原虫的无鞭毛体蛋白基因之间具有高度的同源性。结论实现了墨西哥利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因的克隆化，为进一步研究其表达及作为疫苗研究的候选基因奠定了基础。

巴西利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因的克隆化与序列分析

根据硕大利什曼原虫无鞭毛体蛋白的编码基因序列 ,设计并合成无鞭毛体蛋白基因特异性引物 ,以巴西利什曼原虫基因组为模板 ,进行多聚酶链反应 ( PCR)技术扩增 ,获得 550 bp的基因片段 ,经测序证实 ,巴西利什曼原虫无鞭毛体蛋白的基因含有唯一的开放读码框架 ( ORF) ,为 552 nt,编码的无鞭毛体蛋白由 1 83个氨基酸残基 ( aa)组成。与硕大利什曼原虫及亚马逊利什曼原虫无鞭毛体蛋白一级结构的同源性分别为1 0 0 %和 93.4 4%。

不同种株利什曼原虫前鞭毛体体外向无鞭毛体转化的研究

目的观察不同种株利什曼原虫前鞭毛体在不同体外培养条件下向无鞭毛体的转化。方法将6个对数生长期的不同种株利什曼原虫前鞭毛体接种于含M199和RPMI1640复合培养液的24孔板内,在不同温度、pH值、血清、CO2下培养,第3天和第6天分类计数不同形态的原虫。结果当培养温度为26℃,而其他培养条件发生变化时,利什曼原虫的增殖速度发生变化,大多数原虫保持前鞭毛体典型性形态,运动活跃。当培养温度上升至37℃,不论其他培养条件如何变化,原虫均沉积于培养孔底,停止增殖,运动减缓,显著地向中间体和无鞭毛体转化,酸性pH值和5%CO2可促进前鞭毛体转化为无鞭毛体,新生小牛血清可延长无鞭毛体的成活。但相同的培养条件下,杜氏利什曼原虫转化效率低于其他种株利什曼原虫。结论温度是影响利什曼原虫前鞭毛体转化为无鞭毛体的基本因素,酸性pH值与CO2可协同温度促进转化,不同种株利什曼原虫的遗传异质性可影响转化效率。

利什曼原虫前鞭毛体体外生长动力学研究

目的观察不同种株利什曼原虫前鞭毛体在体外培养条件下的生长增殖情况,确定其最适体外培养条件。方法分别使用RPMI1640和M199复合培养液,观察温度、pH及新生小牛血清对硕大利什曼原虫、热带利什曼原虫、婴儿利什曼原虫、墨西哥利什曼原虫、杜氏利什曼原虫前鞭毛体体外增殖速度与增殖周期的影响。结果当培养温度为26℃时,杜氏利什曼原虫前鞭毛体在含和不含新生小牛血清、pH中性、偏碱和偏酸的PMI1640或M199复合培养基中,早期均能生长,且生长周期相对较长,其他种株利什曼原虫前鞭毛体在无血清或偏碱培养基中生长缓慢,增殖周期缩短;培养温度为37℃时,各种株利什曼原虫前鞭毛体均发生沉积,增殖停滞,不同程度地向无鞭毛体转化并发生死亡。结论使用复合培养液培养利什曼原虫前鞭毛体,温度、pH和新生小牛血清均可显著影响增殖速度和生长周期。各种株利什曼原虫前鞭毛体在相同培养条件下增殖速度和生长周期存在差异,可能与其遗传背景不同有关。

杜氏利什曼原虫前鞭毛体三种不同染色方法的比较

黑热病的主要诊断依据是检出患者体内存在无鞭毛体,但有时由于所得的材料含虫量较少,骨髓等涂片检查往往为阴性,给诊断带来一定困难。为提高病原体检出率和诊断率,常采用体外培养法培养出前鞭毛体后再进行涂片,染色。所以杜氏利什曼原虫前鞭毛体标本是人体寄生虫学实验课程中必须观察的重点内容。杜氏利什曼原虫前鞭毛体标本通常用姬氏染色,鞭毛着色需要较长时间,课上操作费时。本文比较了3种不同的染色方法,其介绍如下。

简便快速实用的杜氏利什曼原虫前鞭毛体培养方法

目的介绍一种简便快速实用的杜氏利什曼原虫前鞭毛体乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)离心管培养方法。方法对1例经形态学和血清学检查确诊的黑热病患者,采集其骨髓液用EDTA-K2离心管培养。结果经本法快速检出杜氏利什曼原虫的前鞭毛体,并经过再次重复试验也获得相同的结果。结论 EDTA-K2离心管培养法是一种简便快速实用的杜氏利什曼原虫前鞭毛体培养方法。

克拉玛依地区的利什曼病——Ⅱ.新疆克拉玛依大沙鼠体内利什曼原虫无鞭毛体的亚显微结构

对新疆克拉玛依大沙鼠体内利什曼原虫无鞭毛体进行了亚显微结构的观察,结果表明虫体较一般致病的利什曼原虫为大。其长为4.21±0.95μm(2.41～5.56μm)宽为1.58±0.34μm(1.10～2.28μm,周长为9.98±2.01μm(6.41～13.21μm),虫体的膜下微管数在有细胞核的切面上为92±13(71～118),而在有鞭毛的切面上则为71±10(59～94),说明虫体不同部位的膜下微管数是不同的。膜下微管的走向并非全呈直线状。微管的直径为25nm,间距为20～30nm;微管间有与内质网相联的弯曲小管,开口于虫体的体表,并有电子致密物联结微管。质膜厚度为8nm。在胞质内有线粒体、内质网、高尔基体等细胞器。此外,还见到菊形管状和包涵体样结构,但其意义不明。

酸碱度对不同来源杜氏利什曼原虫前鞭毛体生长情况的影响

酸碱度对杜氏利什曼原虫鞭毛体 (以下简称鞭毛体 )生长情况的影响 ,前人做过许多实验 ,但对不同来源鞭毛体生长情况的对比观查 ,尚未见报道。本文阐述了酸碱度对不同来源鞭毛体生长情况的影响。值得注意的是在 pH值 4 6 ,8 6时 ,鞭毛体的生长受到抑制 ,以球型形态多见。鞭毛体是利什曼原虫的体外培养形态 ,了解酸碱度对鞭毛体生长情况的影响 ,尤其是对抗锑种株生长情况的影响 ,进一步了解鞭毛体在体外培养时的生长特性及各种株间的生长差异 ,为黑热病的防治提供一些基础资料。