利用超低温保存方法脱除香蕉束顶病毒的研究

香蕉束顶病毒(BBTV)是香蕉生产中的严重病害之一,主要通过感病材料和香蕉交脉蚜等昆虫进行传播,目前尚无有效防治方法。本研究以感染BBTV的巴西蕉(MusaAAA Cavendish)为材料,研究了感染BBTV的巴西蕉离体再生和超低温保存技术条件,表明离体茎尖在MS+6-BA4.0 mg/L+NAA0.4 mg/L的培养基上分化不定芽较好;采用玻璃化法超低温保存技术保存带有BBTV的香蕉茎尖,再生后植株BBTV脱除率达到60.6%,而常规的茎尖培养对BBTV的脱除率仅为26.7%。

香蕉束顶病毒单克隆抗体的制备及其应用

用纯化的香蕉束顶病毒(BBTV)抗原免疫BALB/C小鼠。取脾脏细胞与骨髓瘤NS-1细胞融合。经HAT培养液选择性培养,间接ELISA方法筛选阳性孔。阳性杂交瘤用有限稀释法克隆,间接ELISA法复筛,最后获得201E_3、302C_4两株稳定分泌抗BBTV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。其免疫球蛋白亚类为IgM。纯化后的腹水抗体,用间接ELISA和斑点法(DIA)检测了采自云南河口、个旧和澳大利亚的BBTV病样样品,表现出特异性反应。最高效价达1:64000,培养上清液效价为1:16。经3个月连续培养,仍能稳定分泌抗BBTV McAb.结果表明,已建立了稳定分泌抗香蕉束顶病毒特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株。制备的McAb能应用于香蕉束顶病的诊断和病毒的研究。

香蕉束顶病毒海口分离物Rep基因的克隆、原核表达、抗血清制备及检测

[目的]对香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)海口分离物起始蛋白(replication initiation pro-teins,Rep)基因进行克隆、原核表达、抗血清制备,为BBTV有效的检测及分子流行病学等研究奠定基础。[方法]以海口地区染病香蕉幼嫩假茎和叶片的总DNA为模板,通过PCR技术克隆BBTV海口分离物的起始蛋白基因,连接到表达载体并进行大肠杆菌原核表达,制备高效价特异性抗血清。[结果]应用PCR方法从染毒香蕉幼嫩假茎和叶片总DNA中扩增复制rep基因,回收目的片段后经酶切,获得了含BBTV Rep基因的重组质粒pET32b-Rep。将重组质粒转化E.coliBL21(DE3),经不同的时间、温度及IPTG浓度优化,12%SDS-PAGE电泳分析,在20℃、0.1 mmol/L IPTG条件诱导4h,最终获得大量的可溶性融合蛋白。将可溶性蛋白上清液经Ni2+-NTA亲和层析柱纯化,得到高纯度的融合蛋白。用纯化后的融合蛋白免疫家兔,获得了BBTV Rep蛋白抗血清。以融合蛋白做抗原,间接ELISA法测定抗血清效价大于125 000。以田间样品做抗原时,结果表明抗血清最佳工作浓度为1∶1 000。Western blot鉴定结果表明抗血清能与融合蛋白特异性结合。[结论]利用Rep基因制备的特异性抗血清在BBTV病毒粒体的组装机制研究及病毒病诊断上具有重要的应用价值。

香蕉束顶病毒的纯化及理化特性

从具有典型香蕉束顶病(BBTD)症状的香蕉病组织中提纯了香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)。电镜下可观察到直径为18nm的球形病毒颗粒。最高紫外吸收在255nm,最低紫外吸收在240nm,A_(260)/A_(280)为1.30。用标准BBTV抗体通过ECL-Western转印法测定其外壳蛋白分子量为21kDa。其核酸经DNaseI、RNaseA和Mung Bean Nuclease分析,表明是约1kb的ssDNA。结果与国外文献报道一致。

香蕉束顶病毒海口分离物CP基因的原核表达、纯化及其抗血清制备

用PCR方法从感染香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)的香蕉植株幼嫩假茎和叶片总DNA中扩增外壳蛋白(coat protein,CP)基因。回收目的片段,经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切后与同样酶切的质粒载体pET30a(+)相连接,酶切验证及测序结果获得了含BBTV CP基因的重组质粒pET30a-CP。将重组质粒转化Codon plus表达菌,在25℃、0.4mmol/L IPTG条件下诱导6h或过夜,经12%SDS-PAGE电泳分析可知,该重组菌表达了一个与预期分子量大小一致的His-CP融合蛋白,约为30ku,且主要以包涵体的形式存在。多次洗涤包涵体后得到高纯度的融合蛋白,用其免疫家兔,获得BBTV CP蛋白抗血清。间接ELISA法测定抗血清效价大于51200。Western blot分析表明,抗血清能与融合蛋白特异性结合。

香蕉束顶病毒基因克隆和序列分析

对香蕉束顶病毒（ＢＢＴＶ）中国分离株ＤＮＡ组份Ｉ（ＤＮＡ１）、外壳蛋白（ＣＰ）和运转蛋白（ＭＰ）基因进行了克隆和序列分析。ＢＢＴＶＤＮＡ１含有１１０３个核苷酸，与南太平洋和亚洲分离株分别有８７％８８％和９６％９８％的核苷酸序列同源性。由ＤＮＡ１编码的复制酶含有１８６个氨基酸残基，与南太平洋和亚洲分离株分别有９４４％９５８％和９７６％９８．０％的氨基酸序列同源性。外壳蛋白基因由５１０个核苷酸组成，与澳大利亚分离株有９２５％的核苷酸序列同源性和９８８％的氨基酸序列同源性。运转蛋白基因由３４８个核苷酸组成，与澳大利亚分离株有９０６％的核苷酸序列同源性和８７９％的氨基酸序列同源性。通过比较中国分离株和其它国家分离株的ＤＮＡ１、ＣＰ和ＭＰ基因的核苷酸序列，进一步证明ＢＢＴＶ分离株明显可分为南太平洋和亚洲两组。但是两组分离株ＣＰ基因的氨基酸序列是很相似的。

香蕉束顶病毒株系的研究

采自福建各地蕉区的不同香蕉束顶病毒株类型之间致病性和介体蚜虫的传病率有明显的差异，进一步依其在香蕉品种台湾蕉和Ｗｉｌｉａｍｓ上的反应、香蕉交脉蚜的传病率、毒株类型之间的交互保护和血清学测定结果等，把香蕉束顶病毒区分为ＢＢＴＶ－Ｓ（重型）和ＢＢＴＶ－Ｍ（轻型）两个株系。ＢＢＴＶ－Ｍ和ＢＢＴＶ－Ｓ均能引致香蕉叶片上的青筋症状，两者在血清学上有密切关系，但ＢＢＴＶ－Ｍ仅引致植株产生少量青筋，而ＢＢＴＶ－Ｓ除引致香蕉植株上有大量青筋之外，还引致严重矮化、束顶以及轻度黄化，ＢＢＴＶ－Ｍ的潜育期较ＢＢＴＶ－Ｓ明显长，香蕉交脉蚜对ＢＢＴＶ－Ｓ的传病率大大高于对ＢＢＴＶ－Ｍ的传病率。

香蕉束顶病毒PCR检测技术研究

建立了聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增技术检测香蕉组织和单头蚜虫内的香蕉束顶病毒（ＢＢＴＶ），并报道了ＢＢＴＶ免疫捕捉ＰＣＲ（ＩＣ－ＰＣＲ）和直接结合ＰＣＲ（ＤＢ－ＰＣＲ）检测方法ＩＣ－ＰＣＲ和ＤＢ－ＰＣＲ分别能从４μｇ和０．

香蕉束顶病毒DNA组分6的克隆和序列分析

The DNA component 6 of a Chinese isolate of banana bunchy top virus (BBTV) was cloned and sequenced. It is 1,081 nucleotides in length. Between the component sequences of Chinese and Australian BBTV isolates, there are 85.5% nucleotide sequence identity in full length, 92.5% nucleotide sequence identity in predicted open reading frame (ORF) and 94.8% amino acid sequence identity of potentially encoded proteins. The DNA component 6 is present in all BBTV infections tested, so it may have special function in transmission, infection, replication or movement of BBTV.

应用酶联免疫吸附测定技术检测香蕉束顶病毒

为探讨快速而准确的检测香蕉束顶病毒的方法，采用本所制备的香蕉束顶病毒（Ｂａｎａｎａｂｕｎｃｈｙｔｏｐｖｉｒｕｓ－ＢＢＴＶ）多克隆抗体ＩｇＧ和台湾的香蕉束顶病毒单克隆抗体２Ｈ６，用酶联免疫吸附测定技术（ＥＬＩＳＡ）双抗体夹心法（ＤＡＳ）测定了漳州市天宝的香蕉束顶病病株。试验结果表明，多抗和单抗相结合的ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ法能检测到病组织汁液的最大稀释度为１∶６４０，而单独使用单抗的最大稀释度为１∶１０。同时采用多抗和单抗相结合的ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ法比较了病株根、假茎、叶片中脉、叶肉的测定结果，假茎和中脉的病毒含量高于叶肉，根未检出。用此法能检测到蚜虫体内的病毒。

香蕉束顶病毒的寄主及其在病害流行中的作用

接种测定结果表明：香蕉、粉芭蕉和大蕉等是香蕉束顶病毒的寄主，但美人蕉、芋头、艳山姜、芭蕉芋、姜黄、长春花、甜瓜等其它２４种供试植物不是该病毒的寄主。研究结果还认为：在福建省香蕉产区，香蕉束顶病流行的主要侵染源为香蕉病株，而粉芭蕉和大蕉等病株则可在病区中病害的长期定殖和流行起重要的作用。本文还讨论了这些研究结果对该病害的流行学和防治的重要性。

香蕉束顶病毒海口分离物核穿梭蛋白(NSP)的纯化及抗血清制备

本研究以本实验室保存的含重组载体pDEST17-NSP的原核表达菌株E.coli BL21(DE3)为材料,于25℃、0.1mmol/L IPTG条件下诱导4h,集菌后超声波破碎,获得以包涵体形式表达的约20kD的融合蛋白。实验结果表明,将沉淀的融合蛋白溶于含6mol/L尿素的Binding Buffer中,再经Ni2+-NTA亲和层析纯化后,可获得高纯度的融合蛋白。将纯化融合蛋白经12%SDS-PAGE电泳,切胶回收目的带,液氮研磨并按1:1(W/V)混合佐剂,4次免疫家兔,获得BBTV病毒核穿梭蛋白的特异性抗血清。以融合蛋白作抗原,间接ELISA法测定其抗血清效价为1:5000。田间检测样品的最佳抗血清工作浓度为1:500。Western Blot鉴定结果表明抗血清能与目的蛋白特异性结合。本研究的结果将为下一步NSP基因转录调控和蛋白功能研究奠定一定基础。

应用Digoxigenin标记的cDNA探针检测香蕉束顶病毒

用非放射性的Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记的１１－ｄＵＴＰ取代３２Ｐ标记的ｄＡＴＰ或ｄＣＴＰ，标记克隆的ＢＢＴＶｃＤＮＡ－１０．５ｋｂｃＤＮＡ，制备成探针．通过核酸斑点杂交对粗提取的ＢＢＴＶ，ＢＢＴＶ－ＤＮＡ，感染ＢＢＴＶ的香蕉植物的拟茎，球茎处的组织，新生叶片以及成熟后的叶片进行了检测．结果表明：ＢＢＴＶｃＤＮＡ－１ｃＤＮＡ探针特异性强，不与ＣＭＶ—ＲＮＡ、无毒香蕉组培苗提取的核酸发生杂交反应；仅与粗提ＢＢＴＶ、ＢＢＴＶ－ＤＮＡ、ＢＢＴＶ侵染的香蕉组织的核酸提取物发生杂交反应．此探针灵敏度高，可检出含有ＢＢＴＶｃＤＮＡ－１０．５ｋｂ的质粒ＤＮＡ的最小量为１０ｐｇ；测定感病香蕉植株的拟茎汁液的最高稀释度可达１∶１２８，相当于０．４ｍｇ病蕉组织中的病毒含量．测定同一病株不同部位的结果表明，ＢＢＴＶ在植物体内的分布不均匀，拟茎处组织中病毒含量最高，球茎处的组织以及新生叶片中的病毒含量次之。

香蕉束顶病毒基因组I的克隆及序列分析

以中国漳州地区感染BBTV的香蕉组织总DNA为模板 ,根据我国台湾地区BBTV分离物基因组I序列 ,设计并合成了一对引物 ,通过PCR扩增出约 5 0 0bp的片段。利用pBluescriptⅡSKT -载体获得此片段的克隆 ,经测序表明为BBTV组分Ⅰ的部分序列。由已测知的BBTV基因组Ⅰ序列设计一对相邻引物 ,以我国漳州的感染BBTV香蕉组织总DNA为模板 ,通过PCR扩增出约 1.1kb的片段。利用pBluescriptⅡSKT -载体获得 1.1kb片段的克隆。测序结果表明漳州BBTV基因组Ⅰ含有 110 4个核苷酸 ,其序列与澳大利亚及我国台湾地区的BBTV基因组Ⅰ核苷酸同源性分别为 89%、96 % ,并对此序列的功能进行了推测及讨论。

香蕉束顶病毒的提纯和血清学研究

以香蕉交脉蚜（Ｐｅｎｔａｌｏｎｉａｎｉｇｒｏｎｃｒｖｏｓａ）人工接种表现典型束顶病症状的香蕉组培苗为材料，预预先经氯仿－正丁醇充分乳化的缓冲液抽提和澄清、差速离心、蔗糖垫部分纯化、蔗糖梯度离心，得到粒体完整的直径约１８－２０ｎｍ的球状病毒。提纯的病毒制剂具典型的核蛋白紫外吸收光谱，最高吸收峰在２５７ｎｍ左右，最低吸收峰在２４０ｎｍ左右，Ａ２６０／２８０＝１．３，提纯产量最高可达３．４ｍｇ／ｋｇ组织。用上述提纯病毒作为抗原免疫家兔制备的抗血清，经对流免疫电泳方法测定效价为１：３２。用该抗血清建立的Ａ蛋白夹心ＥＬＩＳＡ（ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ）及与单克隆抗体结合使用的异种抗体双夹心ＥＬＩＳＡ（ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ）能检测各种香蕉束顶病样品。

香蕉束顶病毒NS株系DNA组分6的克隆及序列分析

通过常规的基因克隆技术 ,对香蕉束顶病毒NS株系代表分离物的DNA组分 6进行了克隆和序列分析 ,并将该分离物这个组分的序列与先前报道的广州天河分离物 (属NSP株系 )的该组分序列进行比较 ,结果表明 :该组分全序列、ORF及其编码的氨基酸序列在 2个分离物间的变异率分别为 3 4%、1 7%和 2 6 % .表明该组分在 2个株系代表分离物间存在较显著差异 ,从而进一步支持了广东BBTV存在 2个株系的结论 .此外 ,NS株系代表分离物DNA组分 6的全序列、ORF及其编码的氨基酸序列与澳大利亚分离物的变异率分别为 14.4%、7.5 %和 7.1% .

香蕉束顶病毒中国漳州分离物DNA 4编码区功能研究

利用PCR方法克隆了香蕉束顶病毒中国漳州分离物(BBTV-ZZ)DNA 4编码区,序列分析结果表明该编码区由351个核苷酸组成,推测其编码是一个含116个氨基酸的蛋白质,利用植物双元载体pBin438构建了含有BBTV-ZZ DNA 4编码区的植物组成型表达载体pBBTV-4B,经农杆菌介导转化了三生烟(Nicotiana tabacum Xanthi nc),在防虫条件下,将运动缺陷型CMV-Fny突变株(CMV-Fny-△MP)人工接种到转基因植株下部叶片上,12d后,在转基因植株的非接种叶上显现出不同程度的系统侵染症状,间接异种动物双抗体夹心酶联免疫吸附方法(DAS-ELISA)检测结果显示在转基因植株的上部非接种叶中有CMV-Fny的积累,而非转基因对照植株组的上部非接种叶中始终没有显现系统侵染症状,DAS-ELISA检测也未见CMV-Fny的积累,这些实验结果表明转基因植株能够支持CMV-Fny-△Mp从细胞到细胞和长距离运动并形成系统侵染症状,由此推测BBTV-ZZ DNA 4编码的蛋白质可能具有运动蛋白功能。

香蕉束顶病毒NSP株系DNA组分5的克隆和序列分析

本文利用PCR技术扩增得到香蕉束顶病毒(BBTV)NSP株系DNA组分5的全基因,该基因全长为1 013 nt,具有一个开放阅读框,编码161个氨基酸.NSP株系与南太平洋组澳大利亚、夏威夷、埃及分离物DNA组分5核苷酸和编码的氨基酸序列相比较,核苷酸序列同源率介于88%～89%之间,氨基酸序列同源率介于76%～79%之间,借助进化树分析和生物信息学研究方法,发现NSP株系组分5同样含有保守的与植物体内Rb蛋白结合的、能够调节寄主体内DNA复制相关蛋白积累的功能基序--LYCDE;并预测了蛋白质二级结构和性质.