肺泡上皮细胞条件培养基对血管内皮细胞损伤的影响

目的观察脂多糖(LPS)诱导的肺泡上皮细胞条件培养基对血管内皮细胞炎症反应及细胞损伤的影响,探讨其机制。方法以LPS诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞(A549)条件培养基为刺激物,建立人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤模型。采用细胞增殖与毒性检测试剂盒(CCK-8)检测0%(空白组)、12.5%、25%、50%、75%、100%不同浓度A549细胞条件培养基培养6、12、24和48 h对HUVEC活性的影响;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测A549细胞条件培养基对HUVEC炎症因子〔白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)〕、血管活性物质〔血管内皮生长因子(VEGF)、内皮素-1(ET-1)〕水平的影响;鬼笔环肽染色法观察A549细胞条件培养基对HUVEC形态的影响;蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测A549细胞条件培养基对HUVEC蛋白激酶B/核转录因子-κB(AKT/NF-κB)通路相关蛋白表达的影响。结果与空白组相比,12.5%、25%、50%浓度的A549细胞条件培养基作用6、12、24 h对HUVEC活性无影响,作用48 h后HUVEC活性显著降低,故选择12.5%、25%、50%浓度A549细胞条件培养基作用24 h为诱导条件进行后续实验。与空白组比较,12.5%和50%条件培养基组IL-6水平显著升高(ng/L:2?438.95±64.89、3?036.41±96.69比1?736.75±20.99,均P<0.05),12.5%和25%条件培养基组TNF-α水平显著升高(ng/L:174.08±11.09、81.37±8.17比50.03±0.26,均P<0.01),12.5%、25%和50%条件培养基组VEGF、ET-1水平均显著升高〔VEGF(ng/L):173.60±41.44、192.49±12.38、318.89±27.90比66.68±19.65,ET-1(ng/L):54.88±1.37、36.69±0.29、24.07±0.73比10.67±0.25,均P<0.01〕。鬼笔环肽染色结果显示,25%浓度A549细胞条件培养基诱导的HUVEC细胞形态不规则,大小不均匀,排列紊乱,间隙变宽,微丝结构密集且不清晰,细胞膜呈锯齿样;25%条件培养基组鬼笔环肽染色的细胞荧光强度较空白组显著增加(67?205.60±3?430.40比56?272.67±7?650.95,P<0.05)。Western blotting结果显示,与空白组比较,12.5%、25%、50%条件培养基组HUVEC磷酸化NF-κB抑制因子α(p-IκBα)表达显著降低(p-IκBα/IκBα:0.38±0.08、0.67±0.12、0.31±0.07比1.00±0.00,均P<0.01),磷酸化AKT(p-AKT)、VEGF表达显著升高(p-AKT/AKT:1.50±0.18、1.42±0.27、1.61±0.14比1.00±0.00,EGF/GAPDH:1.37±0.10、1.53±0.22、1.40±0.12比1.00±0.00,均P<0.05),25%条件培养基组磷酸化NF-κB p65(p-P65)表达显著升高(p-P65/P65:1.45±0.14比1.00±0.00,P<0.05)。结论 LPS诱导的肺泡上皮细胞条件培养基可通过激活AKT/NF-κB通路诱导内皮细胞损伤。

淫羊藿苷预处理增强人牙周膜干细胞对M1型巨噬细胞的影响

背景:人牙周膜干细胞对M1型巨噬细胞促炎功能有一定抑制作用,具有抗炎等药理活性的淫羊藿苷是否能增强人牙周膜干细胞对M1型巨噬细胞的抑制作用尚不明确。目的:探究淫羊藿苷预处理人牙周膜干细胞后对M1型巨噬细胞的影响。方法:分离培养原代人牙周膜干细胞,并进行鉴定。对THP-1细胞进行诱导,采用免疫荧光染色及PCR进行M1型巨噬细胞鉴定。用含浓度10^(-7),10^(-6),10^(-5),10^(-4)mol/L淫羊藿苷的α-MEM完全培养基培养人牙周膜干细胞1,3,5,7 d,采用CCK-8法筛选合适的淫羊藿苷浓度进行实验。将α-MEM完全培养基、未处理的人牙周膜干细胞α-MEM条件培养基及淫羊藿苷预处理24 h的人牙周膜干细胞α-MEM条件培养基与RPMI-1640完全培养基以1∶1的比例对M1型巨噬细胞进行条件培养,分别为对照组、未处理组及预处理组,24 h后RT-PCR法检测M1型巨噬细胞炎症因子的mRNA表达情况;ELISA法检测M1型巨噬细胞炎症因子的蛋白表达情况;Western blot检测M1/M2型巨噬细胞表面标记物及核转录因子κB通路相关蛋白的表达。结果与结论:(1)CCK-8检测结果显示,10^(-7),10^(-6),10^(-5),10^(-4)mol/L淫羊藿苷对人牙周膜干细胞均无细胞毒性,且从第5天起,各浓度都提高了细胞活力,促进细胞增殖,选择10^(-4)mol/L淫羊藿苷进行后续实验。(2)RT-PCR法及ELISA检测结果显示,与对照组相比,未处理组及预处理组均降低了M1型巨噬细胞白细胞介素1β、白细胞介素6及肿瘤坏死因子α的表达与分泌(P<0.05),且预处理组低于未处理组(P<0.05)。(3)Western blot检测结果显示,与未处理组相比,预处理组CD86的表达明显降低(P<0.05);与对照组相比,未处理组和预处理组M2型巨噬细胞表面标志物CD206的表达均升高(P<0.01),且预处理组明显高于未处理组(P<0.01);M1型巨噬细胞经24 h条件培养后,与对照组相比,核转录因子κB/P65的表达在未处理组和预处理组均有降低(P<0.01),p-IκBα的表达仅在预处理组降低(P<0.01);与未处理组相比,预处理组核转录因子κB/P65和p-IκBα的表达均显著降低(P<0.05),而IκBα在3组中的表达差异无显著性意义。(4)上述结果证实,淫羊藿苷增强了人牙周膜干细胞对M1型巨噬细胞的抑制作用,此作用可能与抑制了巨噬细胞的核转录因子κB信号通路相关。

1,8-二羟基-3-乙酰基-6-甲基-9,10蒽醌的合成及对卵巢癌细胞的生长抑制

目的:合成1,8-二羟基-3-乙酰基-6-甲基-9,10蒽醌,探讨该合成产物对人卵巢癌细胞(SKOV3)的生长抑制作用。方法:以大黄素为基础结构,化学全合成1,8-二羟基-3-乙酰基-6-甲基-9,10蒽醌;构建SKOV3与人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的交换培养液条件共培养体系,以卡铂为对照药,MTT法检测合成产物对单独培养SKOV3和HUVEC的半数抑制浓度(IC50)及条件共培养体系中两种细胞的IC50。结果:化合物结构经IR,1H-NMR和13C-NMR确证。合成产物和卡铂对单独培养SKOV3的IC50分别为111.72,177.63μmol·L-1,对单独培养HUVEC的IC50分别为198.11,131.53μmol·L-1;合成产物和卡铂对条件共培养体系中SKOV3的IC50分别为104.48,180.7μmol·L-1,对HUVEC的IC50分别为239.22,178.62μmol·L-1。结论:1,8-二羟基-3-乙酰基-6-甲基-9,10蒽醌显示出比卡铂更为优越的抑制卵巢癌细胞生长活性;合成产物对单独培养和条件培养基共培养细胞的IC50值不同,反映了单细胞体系与条件培养基共培养体系在药物筛选结果上的差异。