Smad2条件基因剔除载体的构建及LoxP位点有效性鉴定

Smads家族是最新发现的TGF β信号转导途径中一个重要的新基因家族。SMAD2属于受体激活的SMADs。Smad2在某些肿瘤中发生突变 ,是一种可能的肿瘤抑制基因。Smad2基因完全剔除小鼠在胚胎期E6 .5天死亡。为了研究Smad2在成体各组织器官及肿瘤发生中的可能作用 ,构建了Smad2条件基因剔除载体 ,将LoxP置于Smad2基因组序列C末端功能域两侧 ,并在组成型表达Cre重组酶的大肠杆菌中检测了LoxP位点的功能。该载体的构建为进行Smad2组织特异性基因剔除研究奠定了基础。

后基因组时代的基因剔除——条件基因剔除技术

条件基因剔除利用了Cre-loxP为代表的重组酶系统,通过组织特异性增强子或四环素/类固醇激素受体调控系统控制Cre的表达,使loxP化的靶基因被剔除,因而避免了传统基因剔除方法引起的胚胎致死和复杂表型的缺陷,成为后基因组时代在体研究基因精确功能的首选技术。

Sumf2条件性基因剔除小鼠模型的建立及初步表型分析

目的建立Sumf2条件性基因剔除小鼠模型，为整体水平研究Sumf2基因的生物学功能创造条件。方法运用生物信息学，采用ET克隆、同源重组、显微注射等技术成功建立Sumf2条件性基因剔除小鼠模型，并通过该模型与Ella-cre转基因小鼠交配，获得Sumf2基因剔除小鼠模型，通过PCR、RT-PCR、WesternBlot等方法在不同水平验证Sumf2基因的表达；对该小鼠模型进行初步的表型分析。结果经胚胎干细胞打靶，获得19个正确同源重组的克隆，重组效率为20％：阳性克隆经囊胚注射，获得2只嵌合体雄鼠；嵌合雄鼠与C57BL／6J小鼠交配，获得28只灰鼠，经PCR鉴定16只为杂合子小鼠，阳性率为57％；与Ella—ere转基因小鼠交配，获得了Sumf2基因剔除小鼠模型，DNA、RNA及蛋白水平证明该基因已成功剔除；初步的表型观察未发现Sumf2基因剔除小鼠生长发育、血常规及血生化指标等出现异常改变。结论成功建立Sumf2条件性基因剔除小鼠模型，该基因纯合缺失未发现明显的生长发育异常，为进一步的基因功能研究奠定了基础。

条件转基因技术研究的新进展

转基因技术是近 2 0年发展起来的在体内研究基因功能的分子生物学方法之一 ,近年来在原有技术的基础上 ,取得了许多新进展。综述条件转基因技术研究的新进展。阐明转基因的诱导表达系统和条件基因剔除系统的原理、操作过程以及这两系统各自的优缺点。

重组酶Cre在体外对LoxP标记的基因组进行重组的初步研究

目的 :研究逆转录病毒体系转导的重组酶Cre在体外对LoxP标记的基因组进行重组的能力。方法 :用逆转录病毒表达Cre ,体外感染条件性基因剔除 (即LoxP标记的基因 )小鼠来源的原代培养的牙乳头间充质细胞。从被感染的牙乳头间充质细胞中提取基因组DNA ,用PCR的方法显示LoxP标记的基因组长度的变化 ,从而反映Cre在体外的重组能力。结果 :被表达Cre的逆转录病毒感染的牙乳头间充质细胞 ,其标记的基因组长度发生了预期的变化 ,被标记的部分发生缺失。结论 :用逆转录病毒体系转导重组酶Cre能够有效地对LoxP标记的基因组进行重组。为用这一方法在体外研究特异基因对细胞生物学行为的影响奠定基础。

斑马鱼leg1直系同源基因mu-leg1在小鼠中的表达谱分析

基因leg1(liver-enriched gene 1)首先在斑马鱼中作为肝脏富集表达基因被鉴定。进一步的研究揭示leg1编码的Leg1蛋白代表一类新型外分泌蛋白,它在斑马鱼胚期肝脏生长发育过程中起关键作用。小鼠leg1(mu-leg1)是斑马鱼leg1(zb-leg1)的直系同源基因,二者编码的蛋白氨基酸序列相似性为31%。文章通过巢式PCR从成年小鼠肝脏中成功克隆了mu-leg1的cDNA序列,并对该基因在成年小鼠不同组织中的表达特征进行分析和鉴定。Northern印迹杂交和半定量RT-PCR分析结果显示,mu-leg1在成年小鼠小肠中而非肝脏中富集表达。此外,用制备的mu-Leg1多克隆抗体进行Western印迹杂交,结果显示mu-Leg1也是一个分泌蛋白。同时,还建立了mu-leg1基因条件性剔除杂合子小鼠。这些材料为今后深入研究和探讨mu-Leg1蛋白的生化功能奠定了基础。

逆转录病毒转导的重组酶Cre在体外对LoxP标记的小鼠骨髓细胞DNA重组

目的 :研究逆转录病毒体系转导的重组酶Cre在体外对LoxP标记的基因组进行重组的能力 .方法 :用逆转录病毒表达Cre,体外感染条件性基因剔除 (即LoxP标记的基因 )小鼠来源的原代培养的骨髓细胞 .从被感染的骨髓细胞中提取基因组DNA ,利用PCR的方法显示LoxP标记的基因组长度的剪切前后改变 ,从而反映Cre在体外对LoxP标记的基因组的重组力 .结果 :被表达有Cre的逆转录病毒感染后的骨髓细胞 ,其特定的基因组长度发生了预期的变化 ,被标记的片段部分发生缺失 .结论 :在体外 ,用逆转录病毒体系转导重组酶Cre能够有效地对LoxP标记的基因组进行重组 .

制备遗传工程小鼠的技术改进

遗传工程小鼠是当今生命科学领域集成度最高的研究体系之一。特别在“人类基因组计划和小鼠基因组计划”完成后,遗传工程小鼠在制备人类疾病模型、药物开发和评价、基因功能分析以及比较基因组学中发挥着越来越重要的作用。由此,也推动了遗传工程小鼠相关技术的快速发展。就遗传工程小鼠制备的现况、存在的问题以及新策略等相关问题进行了总结。