条件基因打靶研究存在的主要问题及对策

基于Cre-loxP等位点特异性重组系统的条件基因打靶技术在解析基因功能和制备疾病小鼠模型方面发挥着极其重要的作用。但包括Cre重组酶转基因的表达模式不理想、重组效率存在差异、Cre重组酶的毒性等在内的Cre-loxP重组系统相关的缺陷以及条件基因打靶技术本身存在的问题,如遗传背景、育种策略、实验对照、基因代偿等方面的影响往往被忽略,严重影响基因功能和小鼠表型解析的准确性。针对这些问题,精细调控实现Cre重组酶的理想时空特异性表达、详尽地分析Cre重组酶的重组效率、降低Cre重组酶的毒性、遗传背景单一化、优化育种策略、设立严格实验对照、多基因联合条件基因打靶等诸多解决方案应予以采纳。

家蚕条件基因打靶技术的建立及应用研究进展

条件基因打靶技术是通过借助位点特异性重组酶和预先引入宿主基因组的重组酶特异识别位点,在宿主特定发育阶段的组织或细胞中实现目标基因时空特异性定点插入、删除、替换和倒位等突变操作的技术。目前条件基因打靶技术已被广泛应用于拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、小鼠（Mus musculus）和果蝇（Drosophila melanogaster）等高等真核模式生物的功能基因研究,并逐渐成为转基因动植物研究领域进行基因操作的强有力工具。近年来,国内外多个研究机构系统地开展了家蚕（Bombyx mori）条件基因打靶技术的开发研究,目前已经建立了较为完善的基于多种不同位点特异性重组系统的家蚕条件基因打靶技术平台。本文较为全面地介绍目前最为常用的位点特异性重组系统的组成和作用原理,系统概述基于位点特异性重组系统的家蚕条件基因打靶策略及其应用,并对家蚕条件基因打靶技术存在的主要问题和发展趋势进行讨论。

小鼠Bpi条件基因打靶载体的构建和鉴定

目的构建小鼠Bpi条件基因打靶载体,为建立Bpi条件基因打靶小鼠模型和深入研究Bpi基因功能奠定基础。方法采用Cre/LoxP系统,选择小鼠Bpi基因第2、3外显子作为条件性敲除的目的片段,并在其两侧插入LoxP位点;运用LA-PCR技术,以129品系小鼠ES细胞基因组DNA为模板分步扩增包括Bpi第2、3外显子(中间同源臂)和上游同源臂在内的3.1 kb基因片段以及下游同源臂4.9 kb基因片段;构建pBSKⅡ-5SLoxP和ploxPFRTNeo-3L重组质粒,将前者酶切产物(3.1 kb)与酶切后的ploxPFRTNeo-3L质粒相连获得Bpi条件基因打靶载体。结果经多个限制性内切酶酶切鉴定和测序证实,构建的pBSKⅡ-5SLoxP、ploxPFRTNeo-3L重组质粒和Bpi条件基因打靶载体结构正确,与设计相符。结论成功构建了小鼠Bpi条件基因打靶载体。

基于Cre/LoxP系统的Smad2条件基因打靶小鼠的建立

Ｓｍａｄｓ家族是转化生长因子ＴＧＦ－β信号转导途径中一个重要的新基因家族．ＳＭＡＤ２属于受体激活的ＳＭＡＤｓ．Ｓｍａｄ２基因在多种肿瘤中发生突变，是一种可能的肿瘤抑制基因．Ｓｍａｄ２基因完全剔除导致小鼠在胚胎期６、５ ｄ死亡．为了研究Ｓｍａｄ２在脊椎动物成体各组织器官及肿瘤发生中的可能作用，利用Ｃｒｅ／ＬｏｘＰ系统构建了Ｓｍａｄ２条件基因打靶载体，将两个方向相同的ＬｏｘＰ序列置于编码ＳＭＡＤ２蛋白Ｃ末端功能域序列两侧的内含子中，并在组成型表达Ｃｒｅ重组酶的大肠杆菌中检测了ＬｏｘＰ位点的功能；用打靶载体电击转染小鼠胚胎干细胞，经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交筛选到３株发生正确同源重组的中靶ＥＳ细胞克隆；通过囊胚显微注射将中靶ＥＳ细胞导入受体小鼠囊胚腔，获得了ＥＳ细胞种系嵌合体；对高嵌合度小鼠与Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ的子代小鼠进行基因型鉴定，成功地获得了Ｓｍａｄ２条件基因打靶小鼠．

条件基因打靶技术在组织稳态研究中的应用

基因打靶技术作为最有效的定向修饰小鼠基因组的技术手段在揭示基因的生理功能、研究人类疾病的遗传机制以及寻找新的药物靶标的过程中发挥重要的作用.基于Cre-LoxP定位重组系统的条件基因打靶技术的发展使得基因失活可以限制在特定发育阶段的特定组织或细胞内,这一优势使得条件基因打靶技术成为解析哺乳动物基因功能的主要研究手段.本文将主要介绍军事医学科学院在建立小鼠条件基因打靶技术平台,以及应用这一技术研究TGF-β/Smad等重要信号通路在维持组织稳态和抑制疾病的生理功能和机制方面的主要进展.

条件性基因打靶技术研究进展

以胚胎干细胞技术和同源重组技术为基础的基因打靶技术 (genetargetingtechnology)在先后经历了以自身作为选择标记的同源重组 ,采用正负选择系统的同源重组 ,和进行靶位精细操作的同源重组等 3个阶段后 ,很快发展成为一种日臻成熟的基因操作技术 ,广泛应用于发育生物学、基因功能研究、医学病理模型的建立、基因治疗方法学的研究以及转基因动植物和生物反应器的制备等多个领域。尤其位点特异性重组酶体系如Cre loxp体系在基因靶位操作技术中的应用 ,使得对基因修饰进行精确的时空调控成为可能。

条件性基因打靶及其研究进展

条件性基因打靶是在常规的基因打靶 (基于同源重组原理的基因打靶 )的基础上 ,结合重组酶介导的位点特异性重组技术而发展起来的一种基因打靶新方法。与常规的基因打靶方法相比 ,它对生物基因组的修饰具有时空可控性 ,显示出广阔的应用前景。本文主要就条件性基因打靶的原理、方法。

微小RNA簇miR-302s条件性基因打靶小鼠的制备和鉴定

目的制备微小RNA簇miR-302s条件性基因打靶小鼠。方法构建miR-302s打靶载体，通过电穿孔的方法转染胚胎干细胞（ES细胞），用正负筛选法筛选阳性Es细胞并进行PCR鉴定和Southern分析。利用显微注射技术将正确同源重组的ES细胞注射至B6（Cg）-Tyr〈sup〉c．2J〈／sup〉／J小鼠囊胚腔内，注射后的囊胚植入受体小鼠子宫。将得到的嵌合体小鼠与野生型雌鼠交配获得miR-302s-LoxP基因打靶小鼠。结果获得嵌合体小鼠11只，其中4只嵌合雄鼠嵌合率〉50％。利用嵌合体小鼠进行繁育交配，得到miR-302s基因打靶杂合子小鼠11只。结论成功建立miR-302s条件性基因打靶小鼠模型，为进一步研究miR-302s基因功能打下基础。

基因打靶技术:开启遗传学新纪元

基因打靶技术作为最有效的定向修饰小鼠基因的技术手段在揭示基因的生理功能、研究人类疾病的遗传机制以及寻找新的药物靶标的过程中发挥着重要的作用。近年来,随着条件基因打靶技术的发展使基因失活可以限制在特定时段特定组织或细胞内。文章将主要介绍基因打靶技术的发展简史、近期进展以及在其他模式动物中的应用。

小鼠ADAM10条件性基因打靶载体的构建与鉴定

目的构建小鼠ADAM10条件性基因打靶载体,为建立ADAM10条件性敲除小鼠模型奠定基础。方法以正常小鼠(129/Svj)基因组DNA为模板,采用长片段PCR方法,扩增小鼠ADAM10基因第2外显子及其侧翼序列。通过引入LoxP位点和TK基因等步骤,获得ADAM10条件性基因打靶载体。结果经限制性内切酶酶切鉴定和测序证实,构建的小鼠ADAM10基因条件性打靶载体符合设计要求。结沦成功构建了小鼠ADAM10条件性基因打靶载体,为建立ADAM10条件性基因敲除小鼠打下了基础。

表达Cre酶复制缺陷型重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建Cre-loxP条件性基因敲除系统中Cre酶的重组腺病毒表达载体,作为体细胞条件性基因敲除的基础,并为传统ES细胞条件性基因敲除提供新的选择。方法用pAd-easy系统在大肠杆菌内经同源重组的方法构建Cre酶的复制缺陷型重组腺病毒载体;W estern b lot方法鉴定Cre蛋白的表达。结果在大肠杆菌内构建出重组腺病毒质粒,在包装细胞系内包装出重组病毒颗粒;测定病毒滴度为106pfu/L;重组病毒在细胞内表达Cre蛋白。结论表达Cre酶的重组腺病毒载体构建成功,阳性重组质粒的鉴定方法得以改进,为进一步的体细胞Cre-loxP条件性基因敲除提供了基础。