枯否细胞条件培养基及混合血清对肝星状细胞HSC-T6的刺激作用

目的 探讨枯否细胞条件培养基 (KCCM )、混合的新生牛血清 (NBS)和大鼠血清 (RS)对肝星状细胞 (HSC)增殖和胶原合成的促进作用。方法 采用KCCM、单纯NBS及混合血清刺激大鼠HSC T6细胞 ,用3 H TdR和3 H 脯氨酸掺入法检测HSC增殖活性和胶原合成状况。结果 不同刺激剂作用 4 8h后 ,HSC均体积增大 ,胞突增多延长 ,核分裂像增多。 4 8h的3 H TdR和 96h的3 H 脯氨酸掺入明显增加。结论 混合血清对HSC T6的综合激活作用较KCCM和单纯 10 %NBS的作用明显 ,能明显促进其增殖和胶原合成 。

Y27632条件培养基体外扩增口腔黏膜上皮细胞

目的:通过优化条件培养基用于非牙源性上皮细胞的体外扩增,为进一步开展组织工程牙提供上皮种子细胞来源奠定基础。方法:获取出生后1 d C57BL鼠原代口腔黏膜上皮细胞,接种于含有Y27632的上皮条件培养基的培养瓶内。细胞长满后,消化传代,采用条件培养基与3T3饲养层细胞共培养进行扩增并连续传代,观察细胞生长情况及连续传代后的生物学特性,免疫组织化学进行干细胞鉴定。结果:与传统上皮细胞培养方式相比,含Y27632的条件性培养基加3T3饲养层方式培养的上皮细胞生长迅速,细胞呈立方形或多角形,呈铺路石样排列。免疫组织化学染色表明这些干细胞表达CK14,SOX2和LGR5。连续传代至第7代后,细胞形态、生长曲线和干细胞标志没有明显变化。结论:含有Y27632的条件培养基可有效用于体外大量扩增非牙源性上皮细胞,并能保持干细胞生长特性,有望用于组织工程牙的种子细胞来源。

炎症预激活骨髓间充质干细胞条件培养基修复小肠黏膜急性辐射损伤

背景:间充质干细胞条件培养基被认为是干细胞移植的良好替代方案。既往研究表明,炎症因子的诱导激活能增强间充质干细胞多种生物学潜能,而正常状态的间充质干细胞可能由于免疫活性和迁徙能力不足,无法有效修复损伤组织。目的:探讨炎症预激活前后骨髓间充质干细胞条件培养基对急性辐射损伤小肠上皮治疗作用的差异。方法:分离、培养、鉴定SD幼鼠骨髓间充质干细胞,分别与正常对照和辐射损伤的小肠隐窝细胞株IEC-6在Transwell培养板中共培养24 h,预刺激的骨髓间充质干细胞继续单独培养48 h,收集到的上清液分别为正常状态间充质干细胞条件培养基(MSC-CM NOR)和辐射炎症预激活间充质干细胞条件培养基(MSC-CM IR)。将成年SD大鼠随机分为4组,正常对照组、辐射损伤组、MSC-CM NOR治疗组和MSC-CM IR治疗组,以14 Gy剂量一次性腹部局部照射制备急性小肠辐射损伤大鼠模型,模型制备后尾静脉注射和植入式胶囊渗透压泵腹腔植入联合给药。于治疗后第1,3,7天取小肠组织检测短回路电流和血清木糖水平观察小肠分泌、吸收功能变化。治疗后第3天取小肠组织行电镜观察超微结构改变,治疗后第1,3,5,7,14天取小肠组织行苏木精-伊红染色观察小肠黏膜组织学改变。记录各组大鼠生存状态及生存时间。结果与结论:输注MSC-CM IR后,大鼠小肠短回路电流差值、血清木糖水平较辐射损伤组升高,差异有显著性意义(P<0.05)。苏木精-伊红染色和电镜观察显示从治疗后第3天起MSC-CM IR组小肠黏膜病理改变明显减轻,上皮厚度、紧密连接间隙明显优于辐射损伤组。生存分析显示MSC-CM IR组生存率和平均生存时间明显改善(P<0.05),而MSC-CM NOR组的各项指标与辐射损伤组比较差异无显著性意义(P>0.05)。结果表明炎症激活状态下的骨髓间充质干细胞条件培养基可促进辐射损伤小肠结构和功能的修复。

缺氧诱导骨髓间充质干细胞条件培养基体外修复辐射损伤小肠上皮细胞变化

背景:间充质干细胞条件培养基含有丰富的间充质干细胞旁分泌物质,被认为是干细胞移植理想的替代方案。然而,正常状态的间充质干细胞条件培养基可能由于旁分泌活性不足,常无法有效修复损伤组织。目的:观察缺氧诱导的骨髓间充质干细胞条件培养基(MSC-CM^(Hyp))对大鼠小肠隐窝上皮IEC-6细胞辐射损伤后增殖和凋亡的影响,并进一步探讨其修复小肠上皮细胞的旁分泌机制。方法:IEC-6细胞接受10 Gy X射线照射后分别加入MSC-CM^(Hyp)、正常培养的骨髓间充质干细胞条件培养基(MSC-CM^(Nor)组)及DMEM-F12培养基(DMEM-F12组)培养。结果与结论:锥虫蓝染色、流式细胞仪、Western blot检测结果显示,与DMEM-F12组相比,MSC-CM^(Hyp)组IEC-6细胞存活数和增殖率明显增加(P<0.05),凋亡率和凋亡相关因子Caspases-3/8表达明显下降(P<0.05),而MSC-CM^(Nor)组的各项指标与DMEM-F12组比较差异无显著性意义(P>0.05)。EILSA检测结果显示,与MSC-CM^(Nor)相比,MSC-CM^(Hyp)中血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、和白细胞介素10的含量明显升高(P<0.05)。结果表明,缺氧诱导的骨髓间充质干细胞条件培养基中细胞因子含量明显升高,显著促进辐射损伤IEC-6细胞的增殖,同时下调细胞凋亡信号,从而进一步促进损伤细胞的修复。

脂肪细胞条件培养基对成骨前体细胞成骨分化能力的影响

目的探讨脂肪细胞条件培养基对成骨前体细胞(MC3T3-E1)成骨方向分化能力的影响。方法制备脂肪细胞条件培养基(FCCM)培养3T3-E1,设常规培养液为对照培养基组(CM)。分别在培养7、14d后行Real-time PCR和West-ern-blot检测成骨相关转录因子Runx2(Runt-related transcription factor 2)、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(bone gamma-carbox-yglutamic-acid-containing protein,BGP),并在第14天时行ALP活性检测、ALP染色和茜素红染色。结果 FCCM组较对照组的3T3-E1的Runx2、ALP、BGP基因下调;同时Runx2、ALP、BGP蛋白水平下调;且FCCM组较对照组ALP活性降低,ALP染色和茜素红染色结果均为FCCM组为阴性,对照组阳性。结论 FCCM可下调成骨前体细胞成骨方向分化能力。

不同胎牛血清浓度培养的人脐带间充质干细胞的条件培养基对角膜上皮细胞损伤修复的影响

目的探讨不同胎牛血清(FBS)浓度培养下人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)条件培养液(hUCMSCCM)对角膜上皮细胞损伤修复的促进作用。方法采用贴壁法培养,以含有1%,3%,5%,10%的FBS培养基培养P6代hUCMSCs并收集4种培养条件下的培养基,利用CCK-8方法检测细胞hUCMSCCM对角膜上皮细胞增殖的影响;收集4种hUCMSCCM培养损伤的角膜上皮细胞,检测其对角膜上皮细胞损伤修复的影响;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测4种hUCMSCCM中血小板源性生长因子(PDGF)和白细胞介素-8(IL-8)的含量。结果①收集的4种hUCMSCCM均能促进角膜上皮细胞增殖,随着培养时间的延长,其中1%hUCM-SCCM和3%hUCMSCCM2组条件下,角膜上皮细胞的增殖能力显著高于其他实验组和对照组;②4种hUCM-SCCM均促进角膜上皮细胞的迁移,1%hUCMSCCM在24 h促进角膜上皮细胞损伤修复最为显著,随着时间延长,除10%hUCMSCCM组外其余组均表现出显著的促进角膜上皮细胞损伤修复的能力;③4种UCMSCCM中PDGF的分泌具有差异性,随着血清浓度的增大,PDGF的含量逐渐减少;而IL-8的分泌与血清浓度的增加呈现正相关性。结论不同浓度FBS培养的hUCMSCCM对角膜上皮细胞增殖和损伤修复具有促进作用,其中1%FBS hUCMSCCM在24 h修复和促增殖最为显著;其作用是通过分泌修复因子促进角膜上皮细胞的增殖和迁移,从而保护角膜上皮细胞。干细胞条件培养基将成为角膜上皮损伤的新治疗方法。

炎症诱导骨髓间充质干细胞条件培养基修复急性辐射引起的小肠上皮干细胞损伤

背景:课题组前期发现,炎症预激活的骨髓间充质干细胞条件培养基可促进大鼠小肠急性辐射损伤后的结构和功能修复,该修复作用是否通过调控小肠干细胞得以实现,目前相关研究尚未明确。目的:探究炎症预激活的骨髓间充质干细胞条件培养基对辐射损伤大鼠小肠上皮干细胞的影响,以进一步明确其修复辐射损伤小肠黏膜的机制。方法:(1)分离、培养、鉴定SD幼鼠(中山大学北校区实验中心提供)骨髓间充质干细胞,分别与正常对照和辐射损伤的小肠隐窝细胞株IEC-6在Transwell培养板中共培养24h,预刺激的骨髓间充质干细胞继续单独培养48 h,收集到的上清液分别为正常状态间充质干细胞条件培养基(MSC-CM^(NOR))和辐射炎症预激活间充质干细胞条件培养基(MSC-CM^(IR));(2)将成年SD大鼠(中山大学北校区实验中心提供)随机分为4组:对照组,单纯辐射损伤组,辐射损伤+MSC-CM^(NOR)组,辐射损伤+MSC-CM^(IR)组,每组20只。后3组以14 Gy剂量一次性腹部局部照射制备急性小肠辐射损伤大鼠模型,造模成功后4 h内,单纯辐射损伤组尾静脉注射DMEM-F12培养基,200μL/d,连续注射3 d;辐射损伤+MSC-CM^(NOR)组、辐射损伤+MSC-CM^(IR)组采用胶囊渗透压泵腹腔植入的方式注射MSC-CM^(NOR)和MSC-CM^(IR),胶囊内含2 mL浓缩条件培养基,植入腹腔后以10μL/h的速率匀速释放。于辐射后第1,3,5,7天取小肠组织行免疫组织化学染色、Western blot及qRT-PCR检测。结果与结论:(1)辐射后第3天,位于隐窝基底增殖活跃的Lgr^(5+)小肠上皮干细胞与对照组相比显著减少,几乎难以观察到阳性细胞;而在输注MSC-CM^(IR)后,Lgr^(5+)小肠上皮干细胞与单纯辐射损伤组相比明显增多,MSC-CM^(NOR)组Lgr^(5+)小肠上皮干细胞未见明显增多;(2)辐射损伤后第3天,位于小肠隐窝+4位置相对静止的Bmi1^+小肠上皮干细胞几乎无法观察到;而输注MSC-CM^(IR)后,Bmi1^+小肠上皮干细胞与单纯辐射损伤组相比明显增多,不仅分布在+4细胞位置,还分布在Lgr^(5+)细胞常见的位置,表明Bmi1+细胞在辐射损伤后有可能通过分化为Lgr^(5+)细胞发挥修复效应;(3)Western blot和q RT-PCR进一步验证,MSC-CM^(IR)组的Lgr5表达在同一时间点均明显高于单纯辐射损伤组和MSC-CM^(NOR)组,持续高水平表达后于第7天恢复至正常水平。MSC-CM^(NOR)修复作用较弱,仅在第7天时与单纯辐射损伤组相比差异有显著性意义;(4)结果表明,炎症预激活状态的骨髓间充质干细胞条件培养基具有保护小肠上皮干细胞的作用。

炎症预激活间充质干细胞条件培养基调控坏死性小肠结肠炎小肠炎性反应的作用研究

背景 骨髓间充质干细胞具有强大的免疫调节和抗炎能力.既往研究发现不同状态间充质干细胞条件培养基能下调多种小肠损伤炎性反应,对肠道起到保护作用,但对于坏死性小肠结肠炎(NEC)炎性反应的作用和机制尚未明确.目的 建立新生大鼠NEC模型,探讨炎症预激活间充质干细胞条件培养基调控NEC炎性反应的作用.方法 2018年7月-2019年4月,建立新生大鼠NEC模型,随机选取造模后的80只SPF级新生Sprague-Dawley(SD)大鼠,根据处理方式分为对照组、单纯NEC损伤组、NEC损伤+正常间充质干细胞条件培养基(MSC-CMNOR)组、NEC损伤+经肿瘤坏死因子 α(TNF-α)、白介素(IL)-1β 和一氧化氮(NO)联合培养诱导的炎症预激活间充质干细胞条件培养基(MSC-CMTNF-α+IL-1β+NO)组,每组20只.采用腹腔注射给药的方式,对照组、单纯NEC损伤组、NEC损伤+MSC-CMNOR组、NEC损伤+MSC-CMTNF-α+IL-1β+NO组分别给予等量的0.9% 氯化钠溶液、DMEM-F12培养基、MSC-CMNOR及MSC-CMTNF-α+IL-1β+NO.在注射药物后第4天开腹观察小肠大体标本,收集回肠末端和血液标本,行苏木素-伊红(HE)染色观察小肠病理学变化并进行病理学评分,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对小肠组织及血清标本行炎性因子检测.结果 小肠大体标本变化:对照组新生大鼠小肠色泽红润,无充血,弹性好,有蠕动,未见肠壁积气或坏死.单纯NEC损伤组及NEC损伤+MSC-CMNOR组新生大鼠肠道色泽呈暗红色,充血明显,可见肠壁积气、坏死,弹性差,肠管扩张.NEC损伤+MSC-CMTNF-α+IL-1β+NO组新生大鼠肠道轻度充血,未见肠壁积气或坏死,弹性尚可.小肠组织病理学评分及NEC发生率:对照组、单纯NEC损伤组、NEC损伤+MSC-CMNOR组、NEC损伤+MSC-CMTNF-α+IL-1β+NO组病理学评分总分为16、51、43、16分;4组病理学评分比较,差异有统计学意义(H=41.70,P<0.01).其中单纯NEC损伤组、NEC损伤+MSC-CMNOR组病理学评分高于对照组(P<0.01),NEC损伤+MSC-CMTNF-α+IL-1β+NO组病理学评分较单纯NEC损伤组降低(P<0.01).对照组无NEC发生,单纯NEC损伤组、NEC损伤+MSC-CMTNF-α+IL-1β+NO组、NEC损伤+MSC-CMNOR组分别有17、4、16只诊断为NEC(NEC发生率为85.0%、20.0%、80.0%);4组NEC发生率比较,差异有统计学意义(χ2=44.00,P<0.01).4组血清和小肠组织中促炎因子和抑炎因子水平:4组血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12水平比较,差异有统计学意义(P<0.01);4组小肠组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平比较,差异有统计学意义(P<0.01).其中,与单纯NEC损伤组、NEC损伤+MSC-CMNOR组相比,NEC损伤+MSC-CMTNF-α+IL-1β+NO组血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12水平降低,IL-10水平升高,MSC-CMTNF-α+IL-1β+NO组小肠组织中TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低,IL-10水平升高(P<0.01).结论 炎症预激活间充质干细胞条件培养基对NEC新生大鼠的肠道具有保护作用,能够调控促炎因子和抑炎因子的平衡,减轻肠道的损伤.

炎症预激活骨髓间充质干细胞条件培养基调控急性辐射损伤小肠炎症反应的作用

背景:骨髓间充质干细胞具有强大的免疫调节和抗炎能力。前期实验发现,炎症预激活骨髓间充质干细胞条件培养基可促进急性辐射小肠损伤结构和功能的修复,但其对急性辐射小肠损伤炎症反应的作用机制尚未完全明确。目的:探讨炎症预激活骨髓间充质干细胞条件培养基对急性辐射小肠损伤炎症反应的影响。方法:随机将80只SD大鼠(中山大学北校区实验中心提供)分为对照组、单纯辐射损伤组、辐射损伤+正常间充质干细胞条件培养基治疗组(IR+MSC-CM^(IEC-6(NOR))组)、辐射损伤+辐射炎症预激活间充质干细胞条件培养基治疗组(IR+MSC-CMIEC-6(IR)组),每组20只。使用尾静脉联合腹腔给药,辐射后第1, 3, 5, 7天,取小肠组织行苏木精-伊红染色观察小肠组织学变化,取小肠组织及血清采用ELISA检测炎症因子水平,辐射后第3天取小肠肠系膜淋巴结组织用流式细胞仪检测CD4^+Foxp3^+Treg细胞数量百分比。结果与结论:①与甲单纯辐射损伤组和正常间充质干细胞条件培养基治疗组相比,辐射炎症预激活间充质干细胞条件培养基组小肠上皮绒毛及隐窝结构明显改善;小肠组织中前炎症因子如白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子。水平显著减少,抗炎因子白细胞介素10水平显著升高;血清中前炎因子ActivinA、白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平显著减少,抗炎因子白细胞介素10水平显著升高,以辐射后第3天最为明显;小肠肠系膜淋巴结中CD4^+Foxp3^+Treg细胞数量百分比显著升高,差异均有显著性意义;②上述结果表明,辐射炎症预激活间充质干细胞条件培养基能调控前炎因子和抗炎因子的平衡,增加小肠肠系膜淋巴结中CD4^+Foxp3^+Treg细胞数量,抑制急性辐射小肠损伤全身水平及小肠黏膜的炎症反应,促进小肠黏膜损伤的修复。

炎症激活骨髓间充质干细胞条件培养基对辐射损伤IEC-6细胞的修复

背景:间充质干细胞条件培养基是干细胞移植理想的替代方案,课题组前期研究表明炎症预激活的间充质干细胞条件培养基能促进辐射损伤小肠组织学结构和功能的修复,改善急性辐射损伤大鼠生存状态,但其潜在的细胞机制未进一步探讨。目的:观察炎症预激活的间充质干细胞条件培养基对辐射损伤小肠上皮细胞增殖、凋亡的影响,探讨预激活间充质干细胞条件培养基修复小肠黏膜的细胞机制。方法:小肠隐窝IEC-6细胞分为对照组、辐射损伤组、辐射损伤+MSC-CM^(IEC-6(NOR))组和辐射损伤+MSC-CM^(IEC-6(IR))组,后3组以10 Gy X射线一次性照射IEC-6细胞建立体外急性小肠辐射损伤模型,对照组及辐射损伤组加入DMEM-F12培养基,辐射损伤+MSC-CM^(IEC-6(NOR))组加入正常状态间充质干细胞条件培养基,辐射损伤+MSC-CM^(IEC-6(IR))组加入炎症激活状态间充质干细胞条件培养基。照射后3 d收集细胞行免疫荧光PCNA染色观察增殖改变,行TUNEL凋亡染色及Western blot蛋白免疫印迹法观察凋亡改变。结果与结论:与辐射损伤组相比,辐射损伤+MSC-CM^(IEC-6(IR))组IEC-6细胞PCNA阳性细胞数明显增加(P<0.05),TUNEL阳性细胞数下降(P<0.05),凋亡相关因子Caspases-3蛋白表达明显下降(P<0.05),而辐射损伤+MSC-CM^(IEC-6(NOR))组的各项指标变化无统计学意义(P>0.05)。上述结果表明,与正常状态的间充质干细胞条件培养基相比,炎症激活的间充质干细胞条件培养基显著促进辐射损伤肠上皮细胞的增殖,并抑制其凋亡,促进辐射损伤小肠上皮修复。

肝星形细胞条件培养液对肝癌细胞上皮-间质转化的影响

目的:探讨人肝星形细胞条件培养液(HSC-CM)对肝癌细胞(HCC)上皮-间质转化的影响。方法:采用HSC-CM培养肝癌细胞(SMMC-7721),细胞划痕实验和transwell小室侵袭实验检测HSC-CM对SMMC-7721迁移和侵袭的影响,激光共聚焦显微术(LSCM)和Western blot分析CM培养下SMMC-7721中上皮标志物E-cadherin、间质标志物N-cadherin和Vimentin的表达变化,Western blot检测核转录因子Snail的表达水平。结果:HSC-CM培养的SMMC-7721细胞迁移和侵袭能力增强,和常规培养的SMMC-7721细胞比较,差异有统计学意义(P<0.05);SMMC-7721上皮标志物E-cadherin蛋白表达下调、间质标志物N-cadherin蛋白和Vimentin蛋白表达上调,核转录因子Snail表达上调,与常规培养组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:HSC-CM促进了SMMC-7721的上皮-间质转化。

脂肪间充质干细胞条件培养液联合富血小板纤维蛋白修复小鼠皮肤损伤

背景:富血小板纤维蛋白可促进软组织愈合,间充质干细胞分泌的可溶性因子具有促进皮肤再生的作用,两者联合应用促进皮肤损伤修复尚未见报道。目的:探讨脂肪间充质干细胞条件培养液联合富血小板纤维蛋白对小鼠皮肤创伤愈合的影响。方法:制作C57/BL6小鼠(西南医科大学实验动物中心提供)全层皮肤损伤模型,随机分为4组,每组10只。自造模后即开始治疗,各组分别涂抹脂肪间充质干细胞专用培养基、脂肪间充质干细胞条件培养液、富血小板纤维蛋白、脂肪间充质干细胞条件培养液+富血小板纤维蛋白,3次/d,连续7d。在治疗后的1,3,7,10 d测量创面大小并计算治疗后3,7 d的创面愈合率;治疗后第14天进行创面愈合的组织学分析。结果与结论:(1)与脂肪间充质干细胞专用培养基组相比,其他3组创面愈合时间缩短;(2)治疗后3,7 d,脂肪间充质干细胞条件培养液+富血小板纤维蛋白组的创面愈合率高于其他3组,脂肪间充质干细胞条件培养液组和富血小板纤维蛋白组的创面愈合率高于脂肪间充质干细胞专用培养基组,差异有显著性意义(P <0.05);(3)组织学分析显示,脂肪间充质干细胞条件培养液+富血小板纤维蛋白组小鼠创面白细胞及成纤维细胞聚集、血管新生、肉芽组织重塑、上皮化均比其他3组明显,伤口愈合效果最好;(4)结果表明,脂肪间充质干细胞条件培养液与富血小板纤维蛋白联合应用能有效促进小鼠皮肤损伤的修复,效果优于单独应用脂肪间充质干细胞条件培养液或富血小板纤维蛋白。

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离、培养的适宜条件。方法:采用密度梯度离心法结合贴壁分离法分离培养大鼠骨髓MSCs,观察其形态,流式细胞仪检测细胞表面标记,MTT法观察不同浓度的胎牛血清(FBS)对MSCs生长曲线的影响及不同代MSCs的生长曲线和细胞贴壁率。结果:大鼠MSCs呈梭形或纺锤形,CD34、CD45表达阴性,CD44表达71.5%、CD166表达83.2%;MSCs用10%的FBS培养,其增殖明显高于用无血清、5%及20%的FBS培养;第1、3、5、10代MSCs的生长曲线及细胞贴壁率无明显差异(P>0.05)。结论:密度梯度离心法结合贴壁分离法适于大鼠MSCs的分离;10%的FBS适合MSCs的培养;早期传代对MSCs的增殖无影响。

小肠类器官培养技术的建立和优化

背景:小肠类器官是体外研究肠道上皮最好的工具,应用前景广泛,然而目前国内尚无相关研究报道。目的:在国内建立并优化小肠类器官培养技术,为小肠上皮细胞的基础研究提供平台。方法:常规培养L-WRN细胞,收集含不同浓度胎牛血清(FBS)的条件培养基。处死6~8周龄C57BL/6小鼠,自末端回肠起取约15 cm肠段,纵向剖开,EDTA法分离、收集隐窝上皮,以基质胶包埋多聚化后加入不同浓度梯度的L-WRN条件培养基,显微镜下动态观察出芽情况,待出芽达一定长度后,重新包埋传代培养。结果:与含20%FBS的L-WRN条件培养基相比,含10%FBS的条件培养基更有利于小肠类器官的体外培养。条件培养基浓度为10%、15%、20%、25%、30%均可促使小肠类器官形成,15%条件培养基的出芽率最高。结论:本研究在国内首次成功建立了小肠类器官培养技术,并发现15%L-WRN条件培养基(含10%FBS)更有利于小肠类器官出芽。

无血清培养人胚胎干细胞的体系研究与进展

背景:人胚胎干细胞有永久自我更新和向外、中和内胚层分化的能力,具有重要的基础研究价值和临床应用前景,可应用于再生医学、药物毒性筛选、早期胚胎发育、细胞移植治疗和基因治疗等领域,但是在限定条件下的大规模细胞培养、控制和定向分化技术的发展仍然具有实质性的挑战。在治疗应用方面,许多研究者试图建立可在无异源限定性和规模化培养体系中维持细胞多能性的培养方法。目的:综述近几年报道的人胚胎干细胞的无血清培养体系研究进展,重点是在发展适于治疗用途的无血清和无异源培养体系进程中,面临的挑战和进步。方法:应用计算机检索CNKI和Pub Med学术数据库中2008至2015年关于人胚胎干细胞无血清培养的文章,排除观点重复和陈旧的文章,最后对58篇文章进行归纳汇总。结果与结论:研究者已经在使用人源性饲养层细胞、无饲养层基质及限定性成分培养基上做了许多尝试,旨在选择合适的基质和培养基,使异源性成分达到最小化或者不使用,以求获得临床级别的细胞株。但是目前的细胞制品距离临床应用还有很大的距离,仍有很多问题需要解决,比如细胞制品的规范化、标准化、个性化定制等。相信随着干细胞研究和行业的规范,胚胎干细胞产品将会在临床得到广泛应用。

脂肪间充质干细胞条件培养基及其外泌体促成骨作用的体外研究

目的研究大鼠脂肪间充质干细胞(ASC)条件培养基及其外泌体的体外促成骨作用。方法分离培养原代大鼠ASC和骨髓间充质干细胞(BMSC)并进行鉴定;超速离心法收集/去除条件培养基中的外泌体,采用透射电镜法及粒径分析法鉴定所获取的外泌体;细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测其对细胞增殖的影响;Transwell检测其对细胞迁移的影响;碱性磷酸酶(ALP)活性实验和实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测其对成骨的影响。SPSS 20.0软件、Bonferroni检验进行统计学分析。结果实验所获取的原代BMSC和ASC符合间充质干细胞鉴定标准。透射电镜及粒径分析结果表明所获取的外泌体具有典型的外泌体形态特征。CCK-8实验表明培养7 d后,各处理组中A_(450)值存在差异(F=157.74,P=0.001),BMSC增殖条件培养基组A_(450)值(2.71±0.15)高于对照组(1.95±0.11);去外泌体组的A_(450)值(2.28±0.34)低于条件培养基组。Transwell实验结果表明,培养24 h后各处理组中的迁移细胞数存在差异(F=46.79,P=0.001),条件培养基组迁移细胞数(51.6±1.3)高于对照组(28.6±1.4),去外泌体组迁移的细胞数(37.2±2.2)低于条件培养基组。ALP活性实验结果表明,培养7 d后各处理组中的ALP活性存在差异(F=78.43,P=0.001),条件培养基组ALP活性为(310±11),高于对照组(200±24),去外泌体组ALP活性为(240±19)低于条件培养基组。实时荧光定量PCR检测成骨相关基因的表达,各处理组中的基因表达存在差异(F_(ALP)=32.30,P_(ALP)=0.001;F_(RUNX2)=26.78,P_(RUNX2)=0.001)。结论成骨诱导后大鼠ASC条件培养基及其中的外泌体能够有效的促进BMSC增殖、迁移和成骨向分化,具有体外促成骨作用。

曲靖市某院住院儿童血培养病原菌分布及耐药性分析

目的了解曲靖市某院住院儿童血培养病原菌的分布及耐药情况。方法分析2010年3月至2011年12月曲靖市某医院住院患儿送检的阳性标本,采用全自动细菌分析仪进行病原学鉴定及药敏试验。结果 4 020份血标本共分离出病原菌430株,阳性率为10.70%,其中革兰阳性菌233株,占54.19%,以表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌为主;革兰阴性菌194株,占45.12%,以大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌为主。结论该院住院儿童血培养分离病原菌以革兰阳性菌为主,临床上应重视住院儿童血培养病原菌的耐药情况,加强耐药性监测,合理使用抗菌药物。

坐骨神经源性弥散因子对成年青蛙再生轴突的定向诱导作用

目的 探讨损伤后周围神经产生的活性因子对活体成年青蛙断神经再生轴突的定向趋化诱导作用。方法 通过微型渗透压泵以不同的角度和距离朝被切断的支配左皮胸肌的神经末端提供坐骨神经条件性培养基(conditionedmedium ,CM) 30～ 10 0kD组分 ,形成浓度梯度。 2 8～ 32d后 ,取出胸部组织行免疫组织化学染色示再生的皮胸肌神经轴突 ,并分析再生轴突定向生长的导向值 (directionalvalue)。 结果 再生的皮胸肌神经轴突明显地朝向微型泵管口CM浓度梯度高处生长 ,导向值为 0 84。对照组再生的神经轴突呈无定向生长 ,导向值为 0 0 4。两组间有显著性差异 (P <0 0 0 1)。管口与神经断端间距离和夹角的大小变化对导向值无显著性影响。 结论 损伤后的周围神经可产生分子量介于 30～ 10 0kD可弥散活性因子 。

鼠骨髓间充质干细胞对缺氧-复氧神经元修复的体外实验

目的:观察在体外培养条件下骨髓间充质干细胞对缺氧-复氧新生大鼠大脑皮质神经元活性的影响。方法:实验于2005-01/2006-12在兰州大学第一医院中心实验室完成。健康Wistar大鼠成鼠5只,健康新生Wistar大鼠20只,无菌条件下分离、培养、传代Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,细胞融合达90%时更换培养基培养24h,收集细胞培养液即为骨髓间充质干细胞条件培养基;无菌条件下培养新生Wistar大鼠大脑皮质神经元,第8天随机分为正常对照组、缺氧组、间充质干细胞条件培养基处理组,即用骨髓间充质干细胞条件培养基进行缺氧神经元的修复。分别于缺氧0h、缺氧6h、复氧24h用噻唑蓝盐比色法测定吸光度值和BeckMan全自动生化仪测定培养液乳酸脱氢酶漏出量,分别检测各组神经元的活性和细胞损伤后修复的程度。结果:各实验组均全部进入结果分析。①各组神经元的活性:鼠大脑皮质神经元缺氧6h及复氧24h后缺氧组噻唑蓝明显低于正常对照组,骨髓间充质干细胞条件培养基处理组复氧24h后噻唑蓝高于缺氧组(缺氧6h:缺氧组0.42±0.14,正常对照组0.81±0.12;复氧24h:缺氧组0.35±0.15,正常对照组0.82±0.21,骨髓间充质干细胞条件培养基处理组0.74±0.25,P<0.01或0.001)。②各组细胞损伤后修复的程度:缺氧6h和复氧24h后,缺氧组乳酸脱氢酶漏出量比正常对照组明显增多,骨髓间充质干细胞条件培养基处理组比缺氧组明显减少[缺氧6h:缺氧组(790.16±34.51)nkat/L,对照组(340.07±25.17)nkat/L,骨髓间充质干细胞条件培养基处理组(570.11±53.18)nkat/L;复氧24h:缺氧组(1790.36±252.38)nkat/L,对照组(340.07±19.00)nkat/L,骨髓间充质干细胞条件培养基处理组(860.17±40.17)nkat/L,P<0.001]。结论:在体外培养条件下骨髓间充质干细胞能增加缺氧神经元的细胞活性,促进缺氧神经元的修复。

人脐带源间充质干细胞条件培养液对人肝癌HepG2细胞生长的影响

目的 探讨人脐带源间充质干细胞（HUC-MSC）条件培养液（CM）对人肝癌HepG2细胞生长的影响.方法 选择2011年2月至2014年1月于中国人民解放军第105医院妇产科分娩的35例足月妊娠剖宫产健康胎儿脐带为研究对象,取其用于分离、培养并扩增HUC-MSC.传代扩增至第3代HUC-MSC融合达80％时,更换培养液,继续培养24 h后收集上清液,即为HUC-MSC-CM备用.将对数生长期的人肝癌HepG2细胞按照随机数字表法随机分成相等的3份,分别于含50％,20％及不含HUC-MSC-CM的培养中培养,并分别纳入高含量组、低含量组和空白对照组.采用倒置显微镜观察人肝癌HepG2细胞生长状态,采用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法和细胞划痕愈合实验分别检测3组人肝癌HepG2细胞增殖和迁移情况,并采用流式细胞术（FCM）法检测各组细胞的细胞周期变化情况.本研究遵循的程序符合中国人民解放军第105医院人体试验委员会所制定的伦理学标准,得到该委员会批准,脐带获取前,均征得孕妇知情同意,并与之签署临床研究知情同意书.结果 ①所分离的原代HUC-MSC培养至第3代后,细胞形态开始比较均一.②MTT法检测结果显示,人肝癌HepG2细胞培养24,48和72 h时,3组相对吸光度（A）值比较,差异均有统计学意义（F=21.330,6.223,9.345;P=0.004,0.032,0.027）,且在这3个时间点,高含量组和低含量组相对A值均显著高于空白对照组,差异均有统计学意义（P＜0.05）,高含量组相对A值亦显著高于低含量组,差异亦均有统计学意义（P＜0.05）.③划痕愈合实验结果显示,3组人肝癌HepG2细胞过河时间比较,差异有统计学意义（F=12.860,P=0.025）,且高含量组人肝癌HepG2细胞过河时间短于低含量组和空白对照组,差异均有统计学意义（P＜0.05）,低浓度组人肝癌HePG2细胞过河时间亦短于对照组,差异亦有统计学意义（P＜0.05）.④FCM法检测人肝癌HepG2细胞周期结果显示,3组G0/G1期和S期人肝癌HepG2细胞比例比较,差异均有统计学意义（F=30.600,30.590;P＜0.05）.且与空白对照组相比,高含量组和低含量组人肝癌HepG2细胞G0/G1期细胞比例显著降低,S期细胞比例显著增加,差异均有统计学意义（P＜0.01）;且高含量组G0/G1期细胞比例比低含量组下降更显著,而S期细胞比例显著增加,差异均有统计学意义（P＜0.05）.结论 HUC-MSC-CM可促进入肝癌HepG2细胞增殖和迁移,并可促进人肝癌HepG2细胞周期G1/S转换.