甘蔗条纹花叶病毒 P3 蛋白与甘蔗 Rubisco 大亚基互作的研究

该研究以甘蔗条纹花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)的P3蛋白(SCSMV-P3)为诱饵,采用酵母双杂交技术(yeast two-hybrid system,Y2HS)从甘蔗酵母文库中筛选到1个编码核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase,Rubisco)大亚基的基因,命名为ScRbcL。序列分析表明,该基因开放读码框(open reading frame,ORF)长度为1 337bp,编码478个氨基酸残基。Y2HS和双分子荧光互补(bimolecular flourescence complementation,BiFC)实验表明,ScRbcL与SCSMV-P3存在互作关系。研究认为SCSMV-P3与ScRbcL的互作可能是SCSMV侵染甘蔗导致花叶症状发生的分子基础。

甘蔗条纹花叶病毒HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg基因酵母双杂交诱饵表达载体的构建及自激活检测

为探索甘蔗条纹花叶病毒与甘蔗的互作机制,利用酵母双杂交技术筛选与SCSMV互作的甘蔗因子基因,利用PCR技术克隆了SCSMV的HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg的编码区,构建到酵母双杂交诱饵载体p GBKT7上,获得了p GBKT7-HC-Pro、p GBKT7-P3N-PIPO、p GBKT7-CP和p GBKT7-VPg 4个诱饵载体。结果显示,将重组质粒转化酵母Y2HGold酵母菌株后,酵母菌株在SD/-Trp平板上生长良好,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性;在SD/-Trp/X-α-gal平板上长出白色菌落未变蓝,在SD/-Leu、SD/-Trp/-Ade、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/X-α-gal/Ab A平板上不能生长,表明重组诱饵质粒表达产物对MEL1、ADE2、HIS3和AUR1-C报告基因无自激活作用。构建的诱饵表达载体可以作为诱饵用于文库筛选,为探索SCSMV侵染机制和发病机理奠定了基础。

大麦条纹花叶病毒北京分离物的鉴定

采集北京田间的大麦感病叶片,室内分离病原,血清学检测能够与BSMV新疆株抗血清反应,室内汁液摩擦接种可侵染大麦、小麦、本明烟和苋色藜,能够种子传毒,电镜观察病毒粒子为杆状,同时,国内首次利用RT-PCR扩增出597bp的BSMV外壳蛋白基因.根据以上结果确定分离到的病毒为大麦条纹花叶病毒,其寄主范围和种子带毒率与新疆株系有差别,可能属于不同株系.

大麦条纹花叶病毒新疆株(BSMV-XJ)RNA2 3′端结构分析

本文利用双脱氧序列分析法对我国大麦条纹花叶病毒新疆株(BSMV-XJ)RNA2 cDNA的3′端进行序列分析,证明XJ株RNA2 3′端239个核苷酸与国外典型株3′端相应部位有高度的序列同源性。通过序列分析及使用寡核苷酸定位裂解法和分子杂交确定,在紧邻239个核苷酸的上游有一个Poly(A)结构,3′终端为一个类tRNA结构,亦与国外典型株相同。经分析认为BSMV-XJ3个基因组RNA具有相同的3′端结构。

大麦条纹花叶病毒中国株CP基因克隆分析、原核表达及抗血清制备

首次用PCR方法，自大麦条纹花叶病毒中国株（BSMV-CH）的RNA2（GenBank登录号为：AY789694，未报道）中扩增出外壳蛋白（coat protein，CP）基因，并亚克隆到pMD18-T载体上进行测序分析。结果表明BSMV—CH的CP全长597bp，它与BSMV其它株系CP的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为93．1％～93．8％和91．4％-92．4％；与同属的早熟禾半潜病毒（PSLV）和剪秋罗环斑病毒（LRSV）的核苷酸同源性分别为53．0％和41．8％，氨基酸同源性分别为48．1％和40．0％。根据大麦病毒属病毒已经报道的CP氨基酸序列绘制系统发育树，分析表明分离的各毒株在进化上存在明显地理位置的相关性。把CP基因亚克隆到GST融合表达载体pEGX-6p-1上，优化IFFG诱导终浓度后，在37℃ IFFG终浓度为1．0mmol/L时，融合蛋白GST-CP在大肠杆菌BL21中得到了特异表达。12％SDS—PAGE表明，表达产物大小为48．5kDa，主要以包含体形式存在。对蛋白进行定量后，用冰冷的KCl显色，分离表达的蛋白质特异条带制备抗原，免疫家兔得到抗血清，酶联法（enzyme-linked immunosorbant assay，ELISA）测定的抗血清效价为1／6400。用抗血清对感病大麦和健康大麦进行检测，结果表明抗血清有很高特异性。

大麦条纹花叶病毒新疆株(BSMV-XJ)RNA_2的cDNA克隆及5′端序列分析

分离了大麦条纹花叶病毒(BSMV)新疆株基因组的3个RNA组份。以RNA2为模板,3′端互补寡核苷酸为引物,合成了第一条cDNA链和第二条cDNA链,将ds-cDNA重组在pUC9质粒中,转化大肠杆菌细胞,获得含RNA3′端的克隆,并证明所选克隆的cDNA含有新疆株几近全长的RNA2组份。对于插入片段为3.3kbp的112号克隆进行了酶谱分析,得到了与国外典型株类似的结果;用双脱氧终止法分析了相当于RNA 2 5′端250bp的cDNA酶切片段,表明与国外典型株有十分相似的一级结构。

大麦条纹花叶病毒诱导大麦cDNA文库的构建

构建病毒诱导的寄主植物cDNA文库是利用酵母双杂交方法筛选与病毒相互作用寄主因子的前提条件.该文以大麦条纹花叶病毒接种大麦,在ELISA跟踪检测的病毒复制和运动初期,采集大麦叶片,用TRIZOL法提取总RNA,利用SMART原理进行反转录PCR获得dscDNA,SfiⅠ/XhoⅠ共切后1.1%琼脂糖凝胶检测并分段回收dscDNA,分别与SfiⅠ/XhoⅠ共切的载体连接后,共同转化X-blue感受态细胞构建文库.文库的容量和质量检测结果表明:文库的容量为1.27×106,插入片段大于500 bp,集中在1.2 kb左右,符合酵母双杂交筛选文库的要求.

利用交换接头技术构建大麦条纹花叶病毒新疆株RNA_2的全长cDNA克隆

本文采用双股交换接头(Crossover linker)技术对已建立的大麦条纹花叶病毒新疆株(BSMV-XJ)RNA_2 cDNA重组质粒pUBS_(112)进行修饰。使cDNA两端不必要的poly(dG):poly(dC)尾准确地缺失,同时补上了cDNA中相对于RNA_2 5’端区缺少的三个核苷酸TAA,并在cDNA末端插入了预定的限制酶切顺序。通过原位杂交筛选、酶切图谱分析、cDNA两端序列测定等手段,证明已获得BSMV-XJ RNA_2组分的全长cDNA克隆。

大麦条纹花叶病毒中国株基因组RNA1的全长序列分析

【目的】获得大麦条纹花叶病毒中国株(BSMV-CH)基因组RNA1的全长cDNA,进行序列分析,明确与国外报道株系间的亲缘关系和分类地位【。方法】以自然侵染BSMV-CH的大麦叶片中提取的总RNA为模板,用RT-PCR方法获得BSMV-CH RNA1的全长cDNA,克隆到载体pMD18并测序,用DNAstar软件将获得的序列与GenBank登录的BSMVRNA1序列进行对比,分析各株系序列RNA1之间的同源性,构建系统发育树分析BSMV-CH与国外株系间的亲缘关系。【结果】BSMV-CH的RNA1全长为3795bp(GenBank注册号:AY789693),基因组RNA15′端有一个甲基化的帽子结构,3′端有一个PolyA结构和一段239bp长的类似tRNA的保守序列,BSMV-CH基因组RNA1含有一个长度为3417bp的ORF,推测可编码一个1138个氨基酸的复制酶基因。BSMV-CH的基因组RNA1与国外报道其它株系核苷酸的同源性为95.4%～95.6%。复制酶基因同其它株系核苷酸和氨基酸的同源性分别为94.9%～95.2%和96.5%～96.8%,PolyA的长度比其它株系明显要长。【结论】BSMV-CH和CV42与CV17、ND18、TSE及TSG间的亲缘关系明显低于CV17、ND18、TSG和TSE间的亲缘关系;BSMV-CH与CV42表现相对较近的亲缘关系,但BSMB-CH是不同于CV42的一个BSMV新株系。

微波诱导小麦抗大麦条纹花叶病毒的机制及遗传探索

试验研究表明 ,以 15 %功率比的微波处理携带大麦条纹花叶病毒 (BSMV)的小麦种子 ,能明显提高小麦对BSMV的抗性而增产 ,其诱导机制是提高小麦植株不同部位木质素含量 ,同时提高过氧化物酶的活性 ,减少组织细胞中X体和变异细胞核的数量。由于木质素含量的提高而增强根系对土壤传播病毒禾谷多粘菌的抗入侵、抗扩张能力。上述抗性已知能维持到第 4年。微波处理不能诱导小麦出现突变穗 ,认为微波处理是对小麦细胞质的诱变 ,其抗性机制是细胞质的遗传。

单克隆抗体对小苍兰褪绿条纹花叶病毒及其决定簇的作用特性

采用杂交瘤技术，得到抗小苍兰褪绿色条纹花叶病毒（FCSMV）六个单克隆抗体P3、4A4，6B、，7A6，7D1和7DS。ELISA效价分别为1：1062－1：10^6。7A6攻7D1属于IgG1亚类，7D8和4A4分属IgG2a和IgG2b亚类，P3和6B1属于IgG2亚类。电镜观察单克隆抗体与病毒形成的复合物发现7D1能使病毒粒子发生严重裂断。6株单克隆抗体中P3，4A4、6B1对应于病毒外壳蛋白上的顺序决定簇。纯化的病毒外壳蛋白经酶裂解和改进的盘状电泳分离，得到八段与多克隆抗体反应的收集液。用顺序决定族的单克隆抗体检出P3对应的肽段22和4A4对应的肽段78。本文还讨论了7D1使病毒粒子发生断裂的原因和与病毒粒子表面结构的关系以及分离抗原决定族所在片段的意义。

水稻条纹花叶病毒对介体电光叶蝉生长繁殖及取食行为的影响

【目的】由电光叶蝉Recilia dorsalis传播的水稻条纹花叶病毒(rice stripe mosaic virus,RSMV)目前在我国华南稻区大面积发生并对水稻生产造成严重危害。本研究旨在明确RSMV对介体电光叶蝉生长繁殖及取食行为的影响。【方法】通过生物学实验测定RSMV侵染后电光叶蝉的生长和生命表参数;利用刺吸电位(electrical penetration graph,EPG)技术比较携带和未携带RSMV的电光叶蝉成虫在健康水稻上的取食行为差异;采用Y型嗅觉仪测定电光叶蝉成虫对感染和未感染RSMV水稻的寄主选择倾向性。【结果】与无毒电光叶蝉相比,携带RSMV的电光叶蝉若虫发育历期延长,而若虫存活率、成虫羽化率、雌虫繁殖力和卵孵化率下降。无毒电光叶蝉成虫倾向于选择取食RSMV侵染的水稻,而带毒电光叶蝉成虫倾向于选择取食健康水稻。与无毒电光叶蝉相比,带毒电光叶蝉成虫取食健康水稻所产生的刺探波、障碍波和唾液分泌波次数和持续时间均显著增加,被动取食波和休息波次数减少但时间均延长。【结论】与无毒电光叶蝉相比,感染RSMV使带毒电光叶蝉若虫发育历期延长且不利于其种群的繁殖。RSMV通过调控介体电光叶蝉成虫的取食和寄主选择行为而有利于自身在寄主水稻间的传播。

大麦条纹花叶病毒新疆株RNA5′-末端帽子结构的鉴定

在弱碱条件下一些RNA病毒蛋白外壳可以特异性地从RNA5＇-末端开始剥落,对大麦条纹花叶病毒新疆株(BSMV-XJ)RNA以含帽子结构的TMV-RNA和不含帽子结构的CpMV-RNA为正,负对照,在弱碱条件下剥壳,用合成的pCp特异性地标记RNA5＇-末端帽子结构上的3＇-羟基,经碱水解后纸电泳分离单核苷酸,见BSMV-XJ-RNA和TMV-RNA同样含有m^7G~*p,而CpMV-RNA则无,证实BSMV-XJ-RNA在5＇-末端具有m7G帽子结构,同时对BSMV的蛋白外壳在弱碱条件下剥落的时间,条件及标记方法进行了研究。

新疆大麦条纹花叶病毒的研究 Ⅱ.病毒核酸cDAN的合成及克隆

本文采用改进的新技术从大麦条纹花叶病毒核酸合成互补脱氧核糖核酸,重组质粒及选择特异性克隆。由于技术的改进,简化了操作程序,提高了工作效率。我们以大麦条纹花叶病毒三个组分核酸混合物为模板,寡(dT)8为引物,合成cDNA第一条链,用Gubler和Hoffman缺口翻译法合成第二条链,采用加HindⅢ人工接头的方法将cDNA插入pUC 9质粒载体上,于大肠杆菌JM-103中进行克隆,并以克隆颜色变化表示有无β-半乳糖苷酶活性的直观法,选择含有外源DNA的克隆。再以克隆原位分子杂交法检查克隆对病毒RNA各组分的特异性。仅对RNA_1或RNA_2有特异性的克隆,分别称为pBV_1和pBV_2,另有相当数量的克隆既与RNA_2也与RNA_3杂交,所以称为pBV2+3。用HindⅢ内切酶对一部分RNA_3杂交阳性的PBV2+3进行分析表明,插入的外源基因长度在500～1,000碱基对之间。文中讨论了RNA_2与RNA_3存在同源的可能性。

大麦条纹花叶病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

大麦条纹花叶病毒Barley stripe mosaic virus(BSMV)是我国进境植物检疫性有害生物。为提高大麦条纹花叶病毒检测的灵敏度和特异性,缩短检测周期,根据该病毒不同分离株外壳蛋白(coat protein,CP)基因的保守序列设计特异性的引物和探针,建立了BSMV的实时荧光RT-PCR检测方法。结果表明,本检测方法特异性强,对南方菜豆花叶病毒Southern bean mosaic virus(SBMV)、小麦线条花叶病毒Wheat streak mosaic virus(WSMV)、玉米褪绿斑驳病毒Maize chlorotic mottle virus(MCMV)、烟草环斑病毒Tobacco ringspot virus(TRSV)、菜豆荚斑驳病毒Bean pod mottle virus(BPMV)和番茄环斑病毒Tomato ringspot virus(ToRSV)6种病毒均无交叉扩增;且检测方法灵敏度高,对RNA模板的最低检测限达到5×10^(-4) ng/μL,与双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)和普通RT-PCR相比,本方法的灵敏度分别提高了10倍和100倍。此外,我们利用该方法对12批进口大麦进行检测,发现6批大麦中检出大麦条纹花叶病毒,占比约50%。总之,本研究建立的荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强等优点,适合于BSMV的快速检测。

水稻条纹花叶病毒侵染水稻引起的细胞病理学变化研究

水稻条纹花叶病毒(RSMV)是近年在广东省发现的一种新的细胞质弹状病毒,对水稻生产有严重危害。用携带RSMV的电光叶蝉取食水稻幼苗,获得RSMV侵染的植株。被感染幼苗发育迟缓,叶片有黄色花叶。对病叶超微结构观察发现,病毒粒子首尾相连并集聚成晶状结构分布于细胞质中。细胞质中含有纤维状病毒基质,病毒在其中生成,部分排列成聚集体。成熟病毒粒子由内质网膜芽生,并聚集在扩大的内质网池中,还有病毒分布在核周腔中。部分叶绿体片层结构疏松并瓦解。此外,在叶片表皮细胞和维管束细胞中也发现RSMV侵染的细胞病理学特征。本研究在细胞病理学上证明RSMV对水稻的发育有严重危害。

苏丹草(Sorghum sudanense Stapf):甘蔗条纹花叶病毒新人工寄主(英文)

对苏丹草进行甘蔗条纹花叶病毒(SCSMV)人工接种,其叶片呈现连续褪绿条斑症状。采用RT-PCR和SC-SMV特异性引物SCSMV-ST2(F)、SCSMV-P1(R)对苏丹草染病植株上的甘蔗条纹花叶病毒进行鉴定,结果为阳性;对所获得的PCR扩增产物进行克隆和序列分析,获得0.5kbp片段,在GenBank数据库中的注册号为No.EU650178;通过BLAST比对和系统遗传分析(MEGA 4.0),将其鉴定为甘蔗条纹花叶病毒,这是首次发现苏丹草可作为一种甘蔗条纹花叶病毒的人工选择寄主。

大麦条纹花叶病毒研究进展

一、大麦条纹花叶病毒(Barley Stripe Mosaic Viruts简称BSMV) 根据国际病毒分类命名委员会第四次报告归属于大麦病毒组。这种病毒在世界范围内都有广泛的分布,由于种子能传毒,随着世界性种质资源的流通,BSMV传遍各大洲,一度严重影响世界大麦的产量。在Montana由于此病害从1953—1970年造成三千万美元的损失;1955年仅在Montana和North Dakota就使大麦减产25—30％。在我国新疆各地良种繁殖场上看小麦普遍发明有BSMV侵染。

大麦条纹花叶病毒中国株编码βC蛋白可以自身相互作用

以分别含有BSMV-CH基因组3个组分ds-cDNA全长的pMD-α、pMD-β和pMD-γ质粒为模板,PCR扩增BSMV-CH编码各蛋白基因,克隆至酵母双杂交载体,检测各蛋白是否存在自身激活特性,用酵母双杂交分析BSMV-CH编码蛋白之间的相互作用情况,测定β-半乳糖苷酶活性确认蛋白在酵母体内的作用,Western-blot分析蛋白的体外相互作用。结果表明成功克隆到BSMV-CH编码蛋白基因,并正确克隆至酵母双杂交载体,酵母双杂交检测未发现BSMV-CH编码蛋白之间的相互作用,但确定BSMV-CH编码的βC蛋白可以自身相互作用,体外可以单体或二聚体形式存在。

大麦条纹花叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

大麦条纹花叶病毒为禾本科作物上一种重要的病原,可造成严重的经济损失。该病毒的主要传播方式为种传,因此对种子进行检疫监管是控制病害传播的一种有效途径。本文依据病毒保守序列RNA2beta C蛋白设计引物,研发了一种实时荧光RT-PCR检测方法。经特异性与灵敏度评价,仅对大麦条纹花叶病毒有效,无法对小麦线条花叶病毒、甘蔗花叶病毒及玉米褪绿斑驳病毒的阳性样品进行鉴定;且扩增灵敏度与普通RT-PCR相当,处于0.02 ng/μL水平。该方法相较于已有的检测方法,操作更简便快速,不易污染,灵敏度高,特异性优。此外,本研究结合实时荧光RT-PCR与普通RT-PCR两种检测方法,对未知谷物粉进行大麦条纹花叶病毒的检测鉴定,证实了新方法的可行性。