外周血脑细胞来源细胞外囊泡作为中枢神经系统疾病生物标志物研究进展

脑细胞来源细胞外囊泡(brain cell-derived extracellular vesicles,BCDEVs)是由中枢神经系统(central nervous system,CNS)所有神经细胞共同释放的一组含有其来源细胞生物分子的异质性的双层膜结构纳米囊泡,在脑生理及病理状态下,它们正成为神经元、神经胶质细胞和结缔组织之间通信和废物管理的关键介质。基于不同BCDEVs表面特异性分子标记物,目前研究者已成功从外周血中富集不同BCDEVs亚型包括神经元细胞来源细胞外囊泡(neuron-derived extracellular vesicles,NDEVs)、星形胶质细胞来源细胞外囊泡(astrocytes-derived extracellular vesicles,ADEVs)、少突胶质细胞来源细胞外囊泡(oligodendrocyte-derived extracellular vesicles,ODEVs)、小胶质细胞来源细胞外囊泡(microglia-derived extracellular vesicles,MDEVs)、周细胞来源细胞外囊泡(pericyte-derived extracellular vesicles,PDEVs)和内皮细胞来源细胞外囊泡(endotheliocyte-derived extracellular vesicles,EDEVs)。本篇综述首先概述了细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs),同时对目前使用的用于富集外周血不同BCDEVs特异性分子标记物进行概述,最后重点介绍了外周血BCDEVs在CNS疾病中的应用,以阐明其作为生物标志物的潜力,以及它们在实现这一目标时所面临的挑战。

供体来源细胞游离DNA在移植肾损伤监测应用中的研究进展

供体来源细胞游离DNA(donor-derived cell-free DNA, dd-cf DNA)是指供体细胞凋亡或坏死后释放到体液中的游离DNA,近年来成为了监测移植物损伤的新兴生物标志物之一。本文从供体来源细胞游离DNA的相关临床研究报道进行综述,较全面的总结了供体来源细胞游离DNA的临床应用现状,为其合理使用提供理论参考依据。

脂肪来源细胞和透明质酸钠复合物构建裸鼠皮下软组织

目的探讨脂肪来源细胞(ADCs)作为新型真皮充填物的可能性。方法ADCs取自3例行整复手术的男性患者的残余脂肪组织,支架材料为透明质酸钠。实验分为三组,实验组:ADCs(25×106/mL)与透明质酸钠混合,每一样本0.2mL注射于雌性BLAB/c裸鼠皮下;对照组1:单纯运用透明质酸钠,每一样本0.2mL注射于裸鼠皮下;对照组2:单纯运用ADCs(25×106/mL),每一样本0.2mL注射于裸鼠皮下。8周后取材,通过大体和组织学观察,以及性染色体RT-PCR检测,对再生组织进行评价。结果实验组形成软组织呈球形,平均体积(0.0352±0.0115)mL;组织学观察显示,生物材料完全降解,组织排列紊乱,间有大量排列紊乱的胶原纤维,无脂肪组织;两对照组均无任何组织形成。结论应用组织工程技术,以人脂肪来源细胞为种子细胞,透明质酸钠为支架材料,能构建出良好的组织工程化软组织;为探索一种安全、有效的除皱方法,提供了新的研究方向。

血管黏附分子1(VCAM-1)介导急性病毒性心肌炎小鼠CD34^+VLA-4^+骨髓来源细胞迁移至心肌组织

目的探讨急性病毒性心肌炎小鼠在血管黏附分子1(VCAM-1)的作用下,CD34^+VLA-4^+细胞的动员和定植情况。方法流式细胞术检测CD34^+迟现抗原4(VLA-4)^+细胞在心肌组织、外周血中的变化;实时定量PCR、Western blot法分别检测心肌组织中VCAM-1 mRNA、蛋白的相对水平。结果与对照组比较,急性病毒性心肌炎小鼠心肌中CD34^+VLA-4^+细胞在第3天升高,第7天达到高峰,之后开始下降,第14天和第28天仍高于对照组;外周血中CD34^+VLA-4^+细胞第3天降低,之后开始升高,第7天达到高峰,随后下降,第14天和第28天仍高于对照组。急性病毒性心肌炎小鼠心肌中VCAM-1的mRNA和蛋白含量明显增加。动员到心肌中的CD34^+VLA-4^+细胞与急性病毒性心肌炎VCAM-1呈正相关。结论 VCAM-1促进CD34^+VLA-4^+细胞动员到心肌组织中。

骨髓来源细胞在脉络膜新生血管形成中的作用研究进展

脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)和多种眼病有关,如年龄相关性黄斑变性、中心性渗出性脉络膜视网膜病变、病理性近视黄斑变性、特发性脉络膜新生血管等。CNV是上述疾病造成视力损害的主要因素之一。近年来许多研究发现骨髓来源细胞在CNV的发生和发展中起着重要的作用,本文就此方面的研究进行综述。

新生牛牙龈来源细胞的成骨特性

目的 在不同培养条件下 ,观察新生牛牙龈组织中是否含有具成骨细胞表型特征的细胞。方法 采用体外组织块法培养新生牛牙龈组织来源的细胞 ,根据加矿化液与否分为两组 ,并用免疫细胞 (组织 )化学及体外矿化实验观察其生物学特性。结果 牙龈结缔组织来源细胞在条件培养基中体外培养 14天后 ,骨桥蛋白、骨涎蛋白、骨粘结素及骨钙素等与矿化相关的非胶原蛋白表达阳性 ;碱性磷酸酶表达亦呈阳性 ;而且有散在矿化小结节形成。结论 新生牛牙龈结缔组织中的一些细胞在一定培养环境中可沿成骨细胞方向分化 。

系统评价脐带来源细胞移植治疗脑性瘫痪患者的疗效与安全性

目的:近年来,脐带来源细胞移植治疗脑瘫被认为是具有前景的策略之一。但是,临床证据仍然有限并且有关干细胞治疗脑瘫的临床疗效存在争议。文章系统评价脐带来源细胞移植治疗脑性瘫痪患者疗效与安全性。方法:系统检索了脐带来源细胞移植治疗脑瘫患者的随机对照试验,检索时间为从建立数据库到2020年8月,数据库包括Cochrane图书馆、PubMed、EMbase、中国知网、万方和中国临床试验注册中心数据库。文章对纳入的研究使用了Cochrane偏倚风险评估工具评估文献质量。由2名评价者对符合纳入的研究进行独立的质量评价、数据提取后采用RevMan 5.0软件对结局指标数据进行Meta分析。结果:①共有6篇符合脐带来源细胞移植治疗脑瘫患者的临床随机对照试验,文献质量中等;②Meta分析的结果表明,与对照组相比,脐带来源细胞治疗可以显着提高粗大运动功能测量评分(SMD=0.83,95%CI:0.36-1.30,P=0.000 6)和粗大运动性能评定量表评分(SMD=0.51,95%CI:0.22-0.80,P=0.000 5);③亚组分析结果表明,脐带来源细胞治疗后,脑瘫患者的6个月的粗大运动功能测量评分显著增加(SMD=0.91,95%CI:0.07-1.74,P=0.03);④两组间的上呼吸道感染、腹泻和便秘等不良事件的比较均无显著性差异。结论:脐带来源细胞移植治疗可显著提高脑瘫患者的运动功能,安全性较好,但是由于纳入文献量较少,未来仍需进行大样本、多中心、高质量临床随机对照试验来进行进一步验证。

骨髓来源细胞表达的MMP-2/MMP-13在脉络膜新生血管发生发展中的作用

目的探讨骨髓来源细胞(BMCs)基质金属蛋白酶(MMP)的动态表达及其与脉络膜新生血管(CNV)发生、发展的关系。方法选取成功接受骨髓移植的24只C57BL/6J绿色荧光蛋白(GFP)嵌合体小鼠为观察组,未接受骨髓移植的48只C57BL/6J小鼠为对照组。两组均予激光光凝照射以诱发CNV,利用Western blot法及明胶酶谱法检测对照组在激光诱发前、诱发后1、3、5、7、10、14、28 d时MMP-2/MMP-13的表达情况,利用免疫荧光染色检测观察组CNV中GFP阳性细胞(即移植的骨髓细胞)是否表达MMP-2/MMP-13,并进行定量分析。结果 Western blot法、明胶酶谱法、免疫荧光均显示在激光诱发早期两组CNV中MMP-2的表达即开始快速增加,在诱导第3天表达量最高、活性最强,且观察组BMCs表达MMP-2也在此时达到高峰,占总表达量的63.21%,随后MMP-2表达量开始下降;在激光诱发早期两组CNV中MMP-13的表达缓慢增加,在诱导后第7天表达量最高、活性最强,且观察组BMCs表达MMP-13亦达最高峰,占总表达量的77.87%,随后下降。结论 BMCs可能作为调控靶点改变MMP-2/MMP-13的表达,进而影响血管细胞的出芽、移行、凋亡及CNV纤维化。

骨髓来源细胞体内分化为构成舌的各种细胞的初步研究

目的探索骨髓来源细胞(bone marrow-derived cells,BMDCs)能否迁移至舌,并分化为构成舌的各种细胞。方法采用骨髓移植方法构建具有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)骨髓的C57BL/6嵌合小鼠模型,通过观察胫骨切片中的GFP阳性细胞的分布,判断模型是否构建成功。之后利用嵌合鼠模型,采用免疫组化的方法评价骨髓移植后1、3、6个月时BMDCs在舌内的分化情况。结果骨髓移植后1个月,接受移植的小鼠骨髓内充满了GFP阳性细胞,即建立了嵌合鼠模型。免疫组化结果显示,在嵌合鼠舌内散在分布着大量GFP阳性细胞,包括上皮细胞、朗格汉斯细胞、内皮细胞及结缔组织细胞。结论 BMDCs能够通过循环迁移到舌,在舌内散在分布,并分化为构成舌的多种细胞,参与舌的更新,这为BMDCs应用于舌的再生治疗提供了初步依据。

胎儿肌肉来源细胞的分离及其成肌分化研究

目的观察胎儿肌肉来源细胞(f MDC)体外成肌分化能力以及在mdx鼠体内再生抗肌营养不良蛋白。方法使用含10%新生牛血清的DMEM/F12培养液,采用预贴壁方法从胎儿肌肉组织中分离f MDC。采用免疫染色鉴定肌肉特异标志的表达。肌内注射f MDC到6.5 Gy照射3 d后的mdx小鼠股直肌,1个月后采用免疫荧光染色法和RT-PCR方法检测人抗肌营养不良蛋白和基因的表达。结果采用预贴壁方法可从胎儿肌肉组织中分离到贴壁生长、梭型的f MDC。可在f MDC的一些长纤维细胞包浆中检测到MHC的表达,在一些细胞胞核中检测到成肌素的表达。可在注射f MDC的mdx小鼠肌肉中检测到人抗肌营养不良蛋白和基因的表达。结论 f MDC中存在MHC和成肌素的阳性表达,注射f MDC到照射过的mdx小鼠体内可以再生抗肌营养不良蛋白表达。

人脂肪来源细胞体内构建组织工程化脂肪的实验研究

目的探讨以组织工程技术,应用脂肪来源细胞(Adipose-derived cells,ADCs)体内构建脂肪组织的可行性。方法吸脂术获得人脂肪组织,一部分直接植入裸鼠体内;另一部分用酶消化法分离、培养ADCs,将第三代细胞接种于纤维凝胶(Fibrin glue)支架中,经成脂肪培养液诱导1周后,植入裸鼠体内,4周后取材,用称重法及油红、HE染色检测结果。实验分为直接注射脂肪组、单纯支架组、细胞-支架复合体脂肪诱导组、非诱导组。结果直接注射组在裸鼠皮下形成脂肪组织,但吸收量大;细胞-支架复合体诱导组有大量脂肪类组织形成,油红染色显示组织有脂滴形成;细胞-支架复合体非诱导组和单纯支架组均未发现脂肪组织形成。结论采用组织工程技术将吸脂术获得脂肪来源细胞接种纤维凝胶支架,体内构建脂肪组织,具有可行性。

新生牛血清对大鼠脂肪来源细胞生长的影响

目的探索新生牛血清对大鼠脂肪来源细胞生长状态的影响。方法用新生牛血清代替传统的胎牛血清对脂肪来源细胞进行体外培养,倒置相差显微镜下观察细胞形态,与胎牛血清培养条件下的脂肪来源细胞形态进行比较。结果新生牛血清培养条件下的大鼠脂肪来源细胞镜下呈短梭形或多角形,与胎牛血清培养的脂肪来源细胞形态相似,但细胞在P2～P3代即出现了衰老趋势。结论新生牛血清对体外培养的脂肪来源细胞的活力有负面影响,可能不适用于脂肪来源细胞的培养。

广西卵形鲳鲹小脑来源细胞系的建立及特征分析

【目的】卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)是广西重要的海水经济鱼类,但近年来随着养殖规模扩大,各种病害侵染引起的疾病频繁暴发,给广西卵形鲳鲹养殖产业造成重大损失。建立卵形鲳鲹小脑来源的细胞系(Cell line from cerebellum of Trachinotus ovatus,TOCC),将有利于广西卵形鲳鲹养殖中病毒性病害的分离、鉴定和病害的侵染致病分子机理的研究,以及环境污染和变化的动态监测。【方法】采用胰蛋白酶消化法分离得到卵形鲳鲹小脑组织的原代细胞,并进行原代培养。待原代细胞铺满单层后进行传代培养。对稳定传代的TOCC进行18SrDNA基因测序分析,然后进行生长速率分析和染色体分析,并开展病原菌(溶藻弧菌Vibrio alginolyticus)胞外产物对TOCC的毒性分析。【结果】稳定传代的TOCC为成纤维样细胞,18SrDNA基因分析结果显示其来源于卵形鲳鲹;染色体核型分析发现TOCC具有二倍体特征,特征染色体数目为62条;不同培养条件下TOCC细胞的生长速率不同,28℃生长速度最快;病原菌胞外产物对TOCC具有明显的毒性。【结论】本研究成功建立广西卵形鲳鲹小脑组织来源的细胞系(TOCC)。细菌胞外产物对TOCC细胞毒性结果表明,该细胞系在一定范围内能够替代活体检测,实现体外细胞水平对广西海水养殖中病害侵染和环境污染物的快速检测,为养殖病害的有效预防提供技术支持。

高血糖对小鼠骨髓来源细胞参与脉络膜新生血管形成的体内动态观察

背景 我们先前的研究提示高血糖可加重脉络膜新生血管（CNV）的严重程度,并有可能通过促进骨髓来源细胞（BMCs）的趋化参与血管发生,且已证实在体生物发光成像（BLI）技术能实时、活体观察CNV的动态变化,但糖尿病与CNV发生的关联性尚无明确的研究证据.目的 应用BLI技术并结合组织学研究方法,动态观察高血糖状态下BMCs参与CNV的形成过程. 方法 将荧光素酶-绿色荧光蛋白（FlucGFP）双转基因小鼠的BMCs移植至野生型C57BL/6J小鼠构建嵌合体,嵌合度＞85％的小鼠纳入实验并按照随机数字表法分为对照组和糖尿病组,每组9只.糖尿病组嵌合体小鼠采用腹腔内注射链脲佐菌素法[（STZ60 mg/（kg＆#183;d）,连续5d]建立糖尿病模型,血糖浓度＞15 mmol/L者视为建模成功,对照组不进行注射.2个组嵌合体小鼠均应用532 nm倍频激光视网膜光凝法诱导CNV形成.采用IVIS Kinetics小动物成像系统,分别于CNV模型建立后第1、3、5、7、14、21和28天对2个组小鼠进行BLI检测,动态观察CNV小鼠眼部发光信号.于CNV模型建立后第7天处死动物,制备视网膜脉络膜组织切片行苏木精-伊红染色,比较2个组小鼠CNV的长度和厚度.结果 流式缅胞仪分析显示,C57BL/6J小鼠行Fluc-GFP双转基因小鼠BMCs移植后28 d,纳入实验的嵌合体小鼠平均嵌合度为（88.85±2.46）％;糖尿病组嵌合体小鼠平均血糖浓度为（17.88±0.86） mmol/L.小鼠视网膜脉络膜组织病理学检查显示,CNV造模后第7天,新生血管穿过Bruch膜到达视网膜下腔,糖尿病组小鼠CNV长度为（338.67±33.17） μm,明显长于对照组小鼠的（180.33±24.68） μm,差异有统计学意义（t=8.943,P＜0.05）;2个组间小鼠CNV的厚度差异无统计学意义（t=1.790,P＞0.05）.CNV建模后第1天,两组小鼠眼部出现光学信号,第7天光学信号值均达最高,且糖尿病组明显强于对照组;第14天后两组小鼠眼部信号减弱.CNV建模后第5、7、14和21天,糖尿病组小鼠眼部光学信号均明显强于对照组小鼠,差异均有统计学意义（t=3.411、5.594、5.067、2.663,P＜0.05）.结论 高血糖可促使更多的BMCs参与CNV的形成过程,加重CNV的严重程度.BLI技术可用于评估和比较高血糖条件下BMCs在CNV形成过程中的动态变化.

在体生物发光成像术观察骨髓来源细胞参与脉络膜新生血管的形成

目的评价在体生物发光成像术(bioluminescence imaging,BLI)监测小鼠体内骨髓来源细胞(bone marrow-derived cells,BMCs)参与脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)形成过程的可行性,为BLI研究CNV发生机制奠定基础。方法将荧光素酶-绿色荧光蛋白(Fluc-GFP)双转基因小鼠的骨髓移植到野生型C57小鼠,将嵌合度>85%的嵌合体小鼠分为两组:实验组利用532nm激光建立小鼠CNV模型,对照组不行CNV建模。于CNV建模后1d、3d、7d、14d、21d和28d,利用小动物成像系统对两组小鼠进行BLI观察,高灵敏度CCD采集图像,活体成像软件系统对选取的眼部光学统计区域进行分析。结果建模后第1天,实验组小鼠即有大量BMCs趋化至CNV部位,前3d趋化至CNV部位的BMCs数量增长最快,第7天病变部位BMCs数量达峰值,第14天病变部位BMCs数量降至最低,随后稍有增加,第28天以后保持稳定。对照组小鼠在相应时间点眼内BMCs数量较为稳定,明显低于实验组小鼠(P<0.05)。结论利用BLI可以实时动态示踪体内BMCs向CNV部位的趋化及其在CNV内转归,无创、便捷,为研究CNV发生机制提供了一种新的客观的辅助方法。

优化的供者来源细胞游离DNA检测方法的初步运用

目的报道一种根据中国人群单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)特点优化后的,供者来源细胞游离DNA(donor derived cell-free DNA,dd-cfDNA)检测方法在肾移植中的初步运用。方法使用优化选择的8个SNP位点所形成的dd-cfDNA检测试剂盒(Panel HX-8)检测保存的同种异体肾移植受者的血样,并回顾性分析了受者的临床资料。根据围术期肾功能恢复情况将受者分为5组:移植物功能迅速恢复(immediate graft function,IGF)、移植物功能缓慢恢复(slow graft function,SGF)、移植物功能延迟恢复(delayed graft function,DGF)、血清肌酐(serum creatinine,Scr)反弹(creatinine elevation,CE)以及发生抗体介导排斥反应(active antibody-mediated rejection,ABMR)。结果87例受者的总计330份围术期血样被检测。在其中的84例受者中,IGF组(n=73)的Scr和dd-cfDNA均呈指数型下降,Scr在术后第7天(postoperative day 7,POD7)达到谷平台值(116.2±33.7)μmol/L,而dd-cfDNA在POD5提前达到了谷平台值0.8%±1.5%。SGF组(n=4)和DGF组(n=2)POD1的dd-cfDNA均高于IGF组(28.5%±38.8%比4.0%±3.3%,P=0.003;9.9%±1.8%比4.0%±3.3%,P=0.083)。CE组的平均Scr从(118.6±22.0)μmol/L(POD7)上涨到了(150.8±25.9)μmol/L (POD12),而平均dd-cfDNA则是更早的从1.4%±0.9%(POD5)上涨到了5.4%±9.6%(POD7)。另外3例受者发生ABMR,治疗前后平均dd-cfDNA为4.2%±2.0%比0.6%±0.1%(P=0.399)。结论 Panel HX-8法检测dd-cfDNA的临床实用性高,且dd-cfDNA可能比Scr更能敏感地反映移植肾健康状况。将Panel HX-8在临床上的广泛应用有待后续研究,以进一步明确检测肾移植受者dd-cfDNA的临床价值。

骨髓来源细胞参与肝脏损伤的修复

目的探讨小鼠骨髓来源干细胞（bone marrow stem cells,BMSCs）在体内分化为肝细胞的可行性及BMSCs是否参与肝功能受损的修复。方法 30只雌性C57BL/6小鼠全身一次性接受10 Gy60Co射线照射后,立即接受同品系雄性小鼠骨髓干细胞移植。移植后21 d后以CCl4致骨髓嵌合小鼠肝功能受损,并于CCl4致伤后第2、3、4、7、14、21、28天取骨髓嵌合小鼠肝脏,冰冻切片行Y染色体FISH和白蛋白（albumin,ALB）免疫荧光双标染色法,检测BMSC阳性细胞在受体小鼠肝内的分化情况,ELISA法检测肝脏基质细胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor1,SDF-1）及其趋化因子受体（CXCR-4）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）、干细胞因子（stem cell factor,SCF）的表达。结果伤后2、3、4、7、14、21、28 d骨髓嵌合小鼠肝内皆可见FISH和ALB共表达的双阳性细胞,计数Y染色体FISH与ALB双阳性的细胞数量为3.763%~5.578%。ELISA法检测相关干细胞因子发现,在肝损伤后同一批次各时相点肝脏组织匀浆标本中SDF-1、CXCR-4、SCF、HGF 4种因子均呈现增高趋势,并在肝损伤第21天达到高峰表现,与其他时相点相比显著增加（P〈0.05）,同FISH与ALB荧光双标记共表达计数结果一致。结论 BMSCs可通过直接分化为肝细胞及分泌相关细胞因子间接促进受体肝脏干细胞增殖参与受损肝脏的修复。

炎症体在非骨髓来源细胞中的表达和作用

炎症体是宿主细胞应对内、外源危险信号的应答平台。近年来,越来越多的证据显示非骨髓来源组织细胞(如角质细胞、脂肪细胞等)胞内也有炎症体及炎症体相关蛋白的表达,且这些非骨髓来源细胞胞内炎症体在相应的信号刺激下也可以活化发挥相应的功能。本文将综述炎症体在组织非骨髓来源细胞通过识别危险信号和启动机体免疫应答,对过敏性疾病、自身免疫病和肿瘤等发生发展具有的作用。

组织蛋白酶D对CD11b+髓系来源细胞体外增殖、迁徙和侵袭的影响及侵袭机制

目的:探讨组织蛋白酶D(cathepsin D)对CD11b+髓系来源细胞(BMDCs)体外增殖、迁徙和侵袭的影响,并初步探索侵袭机制。方法:建立预转移期内胰腺癌原位瘤裸鼠模型L3.6pl组或Colo357组和无瘤荷裸鼠模型,流式细胞术检测骨髓和肝脏中CD11b+髓系来源细胞的比例,MTT检测细胞增殖能力,Transwell侵袭小室实验检测细胞的侵袭及迁徙能力,蛋白质印迹法检测分泌蛋白组织蛋白酶D的表达和CD11b+髓系来源细胞中基质金属蛋白酶2(MMP-2)的表达。结果:预转移期内胰腺癌原位瘤L3.6pl组骨髓和肝脏中CD11b+细胞比例明显高于Colo357组(P<0.05)。组织蛋白酶D可以促进CD11b+髓系来源细胞的增殖、迁徙和侵袭,而阻断组织蛋白酶D之后,细胞增殖、迁徙和侵袭则明显地受到抑制。组织蛋白酶D增强CD11b+髓系来源细胞中MMP-2的表达。结论:组织蛋白酶D在诱导CD11b+髓系来源细胞的增殖和迁徙中发挥重要作用,并通过对MMP-2的调控来增强CD11b+髓系来源细胞的体外侵袭能力。