圆二色谱法测定饥饿细胞DNA结合蛋白的突变热点

目的通过引入人为突变,研究DPS分子的稳定性与其一级结构的关系,寻找新型DPS分子。方法选择可能与DPS构象密切相关的氨基酸残基引入突变,经表达、纯化后,利用圆二色谱仪检测突变体蛋白分子的结构变化。结果关键部位氨基酸的突变可以引起DPS分子中α螺旋含量发生了显著的变化。结论某些氨基酸的改变会引起DPS分子整体结构与稳定性的变化,有可能影响、甚至改变蛋白质分子的功能。

乙型和丙型肝炎病毒与肝细胞相互作用的分子生物学基础：启动子DNA结合蛋白研究策略

乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染肝细胞之后，首先要借助肝细胞中的一些成分完成其复制和表达的生活周期，主要是肝细胞中的一些调节蛋白与这2种肝炎病毒调节基因序列之间的结合，并对于肝炎病毒的复制和表达过程进行调节。

8-Br-cAMP和槲皮素诱导Eca-109细胞p16基因启动子DNA结合蛋白的定位研究

目的 :探讨 8 Br cAMP和槲皮素 (quercetin)诱导的Eca 10 9细胞p16基因启动子特异性结合的序列特异性DNA结合蛋白 (DBP)的定位。方法 :应用DBP定位改进方法 ,以制备的特异性DNA探针检测目的DBP在细胞内的定位 ;以免疫细胞化学技术 ,检测细胞PCNA免疫反应性 ,作为肿瘤细胞恶性程度生物标志。结果 :DBP定位信号以胞核为主 ,胞质有阳性信号的细胞 ,胞膜也呈阳性信号 ;2实验组信号比对照组强 ;各组信号均以大细胞更强 ;PCNA免疫细胞化学阳性呈棕黄色颗粒 ,主要位于胞核 ,对照组强于实验组。各组均以大细胞阳性信号更强。结论 :2实验组与p16基因启动子结合的DBP主要位于胞核 ,但核外存在结合潜力的蛋白质。 2实验组PCNA免疫反应性均下降。提示这些与p16基因启动子区结合的DBP在一定程度上可诱导细胞恶性逆转化。

应用噬菌体展示技术筛选细胞周期素B2启动子DNA的结合蛋白

目的筛选细胞周期素B2(cyclinB2)启动子DNA结合蛋白,探索cyclinB2的表达调节机制。方法应用噬菌体展示技术,以cyclinB2启动子DNA片段作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附洗脱扩增”富集过程,噬斑裂解液PCR扩增后,进行DNA序列分析和同源性生物信息学搜索。结果噬菌体经富集后,筛选出20个阳性克隆,成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索,确定了和cyclinB2启动子特异结合的肝细胞蛋白,共编码6种已知蛋白。结论用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到cyclinB2启动子DNA结合蛋白,分析了这些蛋白的功能,为研究cyclinB2基因的转录调节机制奠定了基础。

日本血吸虫脂肪酸结合蛋白DNA联合白细胞介素-12的免疫保护作用

目的 探讨白细胞介素-12 (IL-12)对日本血吸虫脂肪酸结合蛋白 (Sj14FABP)DNA疫苗的辅佐作用。方法 大量制备pVIVO2、pVIVO2 IL-12、pVIVO2 Sj14FABP质粒DNA。48只雄性Balb/c小鼠随机分为A、B、C、D组,每组各 12只,每只小鼠于免疫前 1d在右后腿股四头肌肌内注射 0 75%盐酸布比卡因 30μL。A组给予 0 9%氯化钠注射液 100μL,im;B组给予pVIVO2质粒DNA 100μg,im; C组给予pVIVO2 Sj14FABP质粒DNA 100μg,im;D组给予pVIVO2 Sj14FABP质粒DNA50μg和pVIVO2 IL 12质粒DNA50μg,im。免疫 30d后,每只小鼠以 ( 40±2 )条尾蚴感染,感染 45d后,计数成虫及肝内虫卵;用ELISA法检测小鼠血清中IgG抗体水平。结果 C、D组的减虫率分别为24 11%和 38 83%,减卵率为 27 20%和 40 27%,差异有显著性(P<0. 05);免疫 30d后小鼠血清IgG水平无明显升高,各组间差异无显著性 (P>0 05)。结论 pVIVO2 Sj14FABP能够诱导小鼠产生部分抗血吸虫感染的保护力,IL-12是一种有效的血吸虫病DNA疫苗佐剂。

外源CRE顺式元件对慢性吗啡作用SK-N-SH细胞CREB蛋白表达及DNA结合活性的影响

目的: 研究以cAMP反应元件结合蛋白 (cAMPresponseelementbindingprotein,CREB)为靶点的CREB转录因子诱骗 (CRE transcriptionfactordecoyoligodeoxynucleotide、CRE decoyODN)对慢性吗啡作用SK N SH细胞CREB相关指标的影响.方法: 体外合成含cAMP反应元件 (cAMPresponseelement,CRE)的单链寡核苷酸,以DOTAP为转移介质,将CRE decoyODN与慢性吗啡作用和纳络酮催促戒断的SK N SH细胞共同孵育,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影检测CRE decoyODN细胞掺入;EMSA检测CRE decoyODN与转录因子CREB结合的特异性以及其对慢性吗啡作用SK N SH细胞CREB的DNA结合活性影响;WesternBlot检测CREB 1及磷酸化CREB 1蛋白表达.结果: 以DOT AP为介质,将CRE decoyODN成功导入SK N SH细胞;慢性吗啡作用及纳络酮催促戒断使SK N SH细胞CREB的DNA结合活性和磷酸化CREB 1 蛋白表达明显增高 (P值均<0 01),CREB 1蛋白无明显改变,CRE decoyODN可抑制CREB的DNA结合活性和磷酸化CREB 1蛋白表达的改变(P<0 01),对CREB 1蛋白表达无明显影响.结论: CRE de coyODN可特异抑制慢性吗啡作用及纳络酮催促戒断SK N SH细胞CREB的DNA结合活性和磷酸化CREB 1蛋白表达的增高,对CREB 1蛋白表达无明显影响.

植物血凝素对大鼠周血淋巴细胞DNA结合蛋白的影响

应用原位杂交技术，对大鼠周血分离淋巴细胞以及植物血凝素（ＰＨＡ）刺激的转化淋巴细胞中的ＤＮＡ结合蛋白（ＤＢＰ）的变化，进行了研究。结果显示：①受ＰＨＡ刺激的淋巴细胞显示ＤＢＰ信号百分率显著升高；②受ＰＨＡ刺激的淋巴细胞核内显示ＤＢＰ信号的百分率显著升高，且多为淋巴母细胞；③细胞核外显示ＤＢＰ信号的淋巴细胞百分率在ＰＨＡ刺激后显著升高。提示：ＰＨＡ刺激对淋巴细胞核内、外ＤＢＰ的信号均有增高作用；ＤＢＰ可能参与淋巴细胞的母细胞转化以及细胞间遗传信息的传递。

8-Br-cAMP和槲皮素对Eca-109细胞p16基因启动子DNA结合蛋白及其mRNA表达的影响

目的 :应用Southwestern技术研究 8 Br cAMP和槲皮素 (quercetin)对Eca 10 9细胞DNA结合蛋白与p16基因启动子区的结合调控mRNA表达的影响。方法 :将贴壁培养的Eca 10 9细胞随机分成 3组 ,Br组 :加 8 Br cAMP至终浓度为 2× 10 5mol/L ;Q组 :加槲皮素至终浓度为 4 3μmol/L ;C组 :不加任何药物 ,只加入新培养液培养。同时培养 4 8h ,应用质粒提取及限制性酶切回收目的DNA片段 ,采用生物素随机引物标记探针 ;应用DNA斑点印迹技术检测探针的灵敏度后以Southwestern印迹技术检测与p16基因启动子区特异性结合的DNA结合蛋白 (DBP) ;以原位杂交检测p16基因mRNA的表达情况。结果 :实验组条带强于对照组 ,Br组强于Q组 ;核基质DNA结合蛋白主带位于Mr6 6 0 0 0、5 80 0 0和 2 0 0 0 0 ;核外DNA结合蛋白主带位于Mr4 0 0 0 0、2 80 0 0和 2 0 0 0 0 ;2者中 2 0 0 0 0是共同成分。原位杂交技术显示p16基因mRNA蓝紫色信号颗粒位于胞质 ,杂交信号以实验组较强。结论 :8 Br cAMP和quercetin尤其是前者作用于人食管癌Eca 10 9细胞 ,诱导产生与p16基因启动子结合较强的DBP 。

多聚胞嘧啶结合蛋白E2诱骗RNA对DP210细胞小鼠致瘤能力的影响

目的:慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)急变中伴随着多聚胞嘧啶结合蛋白E2[poly(rC)-binding protein E2,hnRNP E2]的表达异常。本研究初步探讨hnRNP E2诱骗RNA对DP210细胞在动物体内致白血病的作用。方法:分别将稳定表达hnRNP E2诱骗RNA野生序列的DP210-pGD细胞、表达突变序列的DP210-pGM细胞以及对照组DP210细胞通过尾静脉注射CH3小鼠,观察各组小鼠的一般情况以及生存期;外周血白细胞计数(white blood count,WBC)并行外周血涂片及骨髓涂片检查;观察各组小鼠肝、脾和肺组织病理组织学变化。结果:各组小鼠注射不同细胞20 d后,DP210-pGD组小鼠毛色依然发亮,活动力和生长状况较良好,WBC为(8.36±2.81)×109/L,外周血涂片中仅见少量白血病细胞;DP210和DP210-pGM组小鼠的WBC分别为(40.52±12.89)×109/L和(38.73±8.26)×109/L(P<0.01),外周血涂片均可见较多的幼稚白血病细胞。与DP210组和DP210-pGM组小鼠相比,DP210-pGD组小鼠骨髓增生不明显,仍可见许多成熟的粒细胞,肝、脾和肺组织的病理学结构改变较少,白血病细胞浸润程度较低,且生存期明显延长(P<0.01),但最终66 d时全部死亡。结论:hnRNP E2诱骗RNA能延缓DP210细胞对小鼠的致瘤能力。

纤维结合蛋白对人牙周韧带细胞DNA合成及超微结构的影响

采用显微分光光度计图像分析技术及透射电镜观察纤维结合蛋白与人牙周韧带细胞作用后，细胞ＤＮＡ合成和超微结构的变化，结果显示：加纤维结合蛋白组的牙周韧带细胞核面积值、核总吸收值和核平均吸收值均较对照组高（Ｐ＜０．０１），提示纤维结合蛋白可促进牙周细胞ＤＮＡ的合成。超微结构示纤维结合蛋白组细胞核内常染色质含量明显较对照组丰富，且胞浆中含有更多量的微丝、线粒体等细胞器，表明在促进牙周愈合时，纤维结合蛋白可能通过调节微丝聚合度、刺激某些蛋白质合成而起作用。

DNA甲基结合蛋白2调节少突胶质前体细胞终末分化的作用及机制

目的探究DNA甲基结合蛋白(MeCP)2调节少突胶质前体细胞(OPCs)终末分化的作用及机制。方法 (1)采用Western印迹方法观察MeCP2沉默对OPCs分化成熟的影响;(2)运用甲基特异性聚合酶链反应(PCR)(BSP)和定量实时PCR(qRT-PCR)探究少突终末标志物内转录因子Sry相关Box17因子(SOX)10、DNA甲基结合蛋白(MBP)、髓鞘相关糖蛋白(MAG)、髓鞘脂蛋白(PLP)甲基化和表达变化。结果与正常细胞相比,在MeCP2沉默的OPCs中,与OPCs分化成熟相关2',3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶(CNP)重组蛋白表达明显上调,同时SOX10、MBP、MAG、PLP表达均明显上调;但呈现低甲基化水平。结论 MeCP2沉默可促进OPCs终末分化标志物的表达及甲基化水平的降低,从而促进OPCs成熟分化。

DNA结合分化抑制蛋白-1促进乳腺癌细胞干细胞特性与血管形成的机制初探

目的探究DNA结合分化抑制蛋白-1(ID-1)对乳腺癌细胞干细胞特性与血管形成的影响及其分子机制。方法免疫组织化学染色检测乳腺癌组织和癌旁组织中ID-1表达;将SUM159细胞以脂质体介导转染法过表达或抑制ID-1水平,分为Control组、shRNA-NC组、shRNA-ID-1组、pcDNA3.1-NC组、pcDNA3.1-ID-1组,实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blot检测转染效果;平板集落形成实验检测细胞集落形成能力,肿瘤球形成实验检测细胞自我更新能力,小管形成实验检测HUVECs成管能力,免疫荧光染色法和Western blot检测Src激酶活化情况。结果乳腺癌组织中ID-1阳性表达率显著高于癌旁组织(P<0.05);转染shRNA-ID-1可抑制SUM159细胞中ID-1 mRNA与蛋白表达(P<0.05),在SUM159细胞中抑制ID-1表达后,细胞集落形成数目减少(P<0.05),肿瘤球体体积变小,球体数目减少(P<0.05),HUVECs形成的分支点数减少(P<0.05),p-Src荧光表达减弱,p-Src蛋白表达水平下调(P<0.05);转染pcDNA3.1-ID-1可提高SUM159细胞中ID-1 mRNA与蛋白表达(P<0.05),而过表达ID-1能够增加细胞集落形成数目(P<0.05),使肿瘤球体体积增大,球体数目增多(P<0.05),HUVECs形成的分支点数增加(P<0.05),同时,细胞内p-Src荧光表达明显增强,p-Src蛋白表达水平上调(P<0.05)。结论ID-1能够增加乳腺癌细胞干细胞特性,促进乳腺癌血管形成,这一作用机制可能与激活Src激酶途径相关。

染色质解旋酶DNA结合蛋白对舌鳞状细胞癌CAL27细胞侵袭和转移影响的研究

目的探讨染色质解旋酶DNA结合蛋白(CHD1L)影响舌鳞状细胞癌侵袭和转移的分子机制,为临床抑制舌鳞状细胞癌的侵袭和转移提供新的靶点。方法运用Ualcan网站分析CHD1L在正常上皮组织和原发性头颈鳞状细胞癌组织中的表达情况,分析有无淋巴结转移对头颈鳞状细胞癌组织中CHD1L表达情况的影响;通过GEPIA网站分析CHD1L在头颈鳞状细胞癌中的表达与生存率的关系;蛋白质印迹法检测人舌鳞状细胞癌细胞CAL27和人正常皮肤细胞HaCaT中CHD1L蛋白的表达水平;用RNA干扰质粒敲低人舌鳞状细胞癌细胞CAL27中的CHD1L后,将细胞分别命名为SiCHD1L/CAL27及Scr/CAL27;蛋白质印迹法检测CHD1L在每组细胞中的表达情况;EdU增殖实验检测每组细胞增殖能力的改变;伤口愈合实验检测每组细胞迁移能力的改变;蛋白质印迹法检测上皮间质转化(EMT)标志物上皮钙黏着蛋白和波形蛋白的表达水平。结果Ualcan数据库显示:CHD1L在原发头颈鳞状细胞癌组织中表达高于正常上皮组织中的表达,在出现淋巴结转移的头颈鳞状细胞癌组织中表达更高。GEPIA网站分析显示:CHD1L表达量高的头颈鳞状细胞癌患者总生存率较表达量低的患者明显降低。蛋白质印迹结果显示:人舌鳞状细胞癌细胞CAL27中CHD1L表达高于人正常皮肤细胞HaCaT中CHD1L的表达,敲低CHD1L以后CAL27细胞中CHD1L的表达量明显低于Scr/CAL27组细胞。EdU增殖实验结果显示:SiCHD1L/CAL27组细胞增殖能力明显降低。伤口愈合实验显示:SiCHD1L/CAL27组迁移能力降低,SiCHD1L/CAL27组细胞上皮钙黏着蛋白表达量增加而波形蛋白表达量降低。结论CHD1L促进舌鳞状细胞癌细胞的EMT,促进舌鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移侵袭能力。

单链DNA结合蛋白2对小鼠胚胎干细胞向滋养层方向分化的作用

目的寻找并鉴定可促进小鼠胚胎干细胞(ES细胞)向滋养层方向分化的新基因。方法优化小鼠ES细胞向滋养层方向分化的诱导条件,结合数据分析寻找在此分化过程中表达上调的基因,由此发现了单链DNA结合蛋白2(Ssbp2)。通过qRT-PCR检测Ssbp2在小鼠ES细胞向滋养层方向分化过程中的表达变化,并检测Ssbp2在小鼠早期胚胎对应的3种细胞类型中的表达模式。克隆Ssbp2基因并将其在小鼠ES细胞中过表达,观察细胞形态并检测其是否具有促进小鼠ES细胞向滋养层方向分化的功能。结果通过尝试不同的组合,发现在无血清的小鼠滋养层干细胞(TS细胞)基础培养液中添加BMP4联合b FGF既可诱导小鼠ES细胞中滋养层标记基因的显著上调,又可有效抑制中胚层标记基因的上调。通过表达模式分析发现,在诱导小鼠ES细胞向滋养层方向分化过程中Ssbp2的表达量发生了显著上调,并且Ssbp2在TS细胞中高表达。当在小鼠ES细胞中过表达Ssbp2之后,ES细胞发生了一定程度的分化,并且滋养层相关的标记基因发生了最为显著的上调。结论 Ssbp2具有促进小鼠ES细胞向滋养层方向分化的作用。

表面活性蛋白A-聚赖氨酸结合物将DNA转染至培养的呼吸道细胞中

肺表面活性蛋白A(SP-A)是在肺泡裘面含量非常丰富的一种表面活眭剂相关蛋白。本文研究将SP-A通过共价键与21kD的聚赖氨酸交联形成结合物[Lys]21kD-SP-A作为载体，体外转染人的肺腺癌细胞系H441细胞。将分子量为20900D的酸与纯化的ASP-A经化学方法人工合成[Lys]21kD-SP-A结合后与携带细菌氯霉索乙酰基转移酶(CAT)基因的质粒pCPA-RSV混合并感染H441细胞，

人巨细胞病毒IE基因调节子特异DNA结合蛋白cDNA的克隆和鉴定

本文利用人巨细胞病毒(HCMV)IE基因调节子中特异DNA片段作为探针,自人Hela细胞cDNA表达库中筛选并分离出两个编码能与该探针结合的DNA结合蛋白cDNA克隆(DJ-1和EH-2)。其中EH-2编码的蛋白具有明显的DNA结合序列特异性。比较DJ-1和EH-2克隆在HCMV戚染不容性和可容性畸胎瘤细胞中mRNA表达水平,未见明显差异。DJ-1和EH-2克隆可能涉及IE基因表达调控过程。

白细胞介素-12在日本血吸虫脂肪酸结合蛋白诱导小鼠保护性免疫力中的佐剂作用

目的研究白细胞介素-12(IL-12)对日本血吸虫脂肪酸结合蛋白(Sj14FABP)DNA疫苗的免疫增强效果。方法分别构建pVIVO2-Sj14FABP和pVIVO2-IL12-Sj14FABP疫苗,鉴定构建成功后免疫小鼠。48只雄性BALB/c小鼠随机分为A、B、C和D等4组,分别用0.9%NaCl(对照组)、pVIVO2、pVIVO2-Sj14FABP和pVIVO2-IL12-Sj14FABP肌注免疫1次(100μg/只)。免疫后30d各组小鼠感染40±2条尾蚴,感染后45d剖杀,计数成虫及肝内虫卵;同时用ELISA法检测小鼠血清中IgG抗体水平,用双夹心ELISA法检测脾淋巴细胞经伴刀豆球蛋白A(ConA)和可溶性虫卵抗原(SEA)刺激后培养上清中白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)和干扰素-γ(IFN-γ)含量。结果经PCR和酶切鉴定,成功构建pVIVO2-Sj14FABP和pVIVO2-IL12-Sj14FABP重组质粒;C、D组免疫后分别获得24.1%和39.4%的减虫率、27.2%和32.8%的减卵率;细胞因子检测结果,D组经ConA和SEA诱生的IL-2和IFN-γ水平显著增高(P<0.01),而IL-4水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.01);免疫后30d小鼠血清IgG水平无明显升高,各实验组间差异也无统计学意义(P>0.05)。结论Sj14FABPDNA疫苗可诱导BALB/c小鼠产生部分抗血吸虫感染保护作用,细胞因子IL-12能够诱导机体免疫反应向Th1型优势分化,并增强血吸虫病DNA疫苗免疫保护性效果。

非同位素法分析序列特异性DNA结合蛋白的三种方法

目的为在转录调控水平研究蛋白质异常表达机制,利用核转录因子与相应DNA调控序列特异结合的原理,非同位素法分析细胞内序列特异性DNA结合蛋白。方法凝胶滞留实验(EMSA)采用Dig-ddUTP末端标记DNA,核蛋白粗提或纯化产物与之液相结合后,PAGE分离核蛋白并转印至尼龙膜,化学发光法检测结果,Southwestern分析方法首先采用SDS-PAGE分离核蛋白粗提或纯化产物,蛋白转印至膜上后与Dig-dUTP末端标记的DNA杂交,酶免疫学检测结果,磁性DNA结合蛋白纯化法则将靶DNA与商品化磁性DNA粒子相连,用不同的连接、洗脱条件得到序列特异性靶DNA结合蛋白,银染显示核蛋白纯化结果。结果 EMSA中由于游离DNA与DNA-蛋白复合物有不同电泳迁移率,出现滞后DNA条带提示有识别该特定DNA序列的核蛋白存在,Southwestern分析除能提示核抽提物中有无可与DNA结合的核蛋白外,还提示其中核蛋白分子质量,核蛋白粗提物经磁性DNA亲和层析后DNA结合蛋白在银染时出现较纯的特异识别该DNA序列的核蛋白条带。结论 EMSA,Southwestern分析及磁性DNA层析是3种实用的研究DNA结合蛋白的方法,配伍应用具有简便、重复性好、敏感性和特异性高、无同位素污染等优点,是转录调控水平研究疾病相关基因异常表达的有效方法。

人巨细胞病毒UL55编码蛋白结合蛋白的筛选与鉴定

从人胎脑c DNA文库中筛选和鉴定出与人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)UL55编码蛋白结合的蛋白。将UL55基因编码区克隆到诱饵载体p GBKT7中,在证实UL55蛋白不具有自激活作用的前提下,采用Match-maker GAL酵母双杂交系统筛选人胎脑c DNA文库中与UL55蛋白结合的宿主蛋白,用酵母双杂交回转实验验证UL55蛋白与获得的蛋白结合的可靠性。将酵母双杂交筛选出的文库蛋白烯醇化酶1(enolase1,ENO 1)构建到p GEX-4T-2载体上,利用GST pull-down技术体外验证ENO 1与HCMV UL55蛋白的结合。并依据所筛选出蛋白的生物学功能分析UL55蛋白可能的生物学功能。结果显示有10种蛋白与HCMV UL55编码蛋白结合。应用GST pull-down技术检测到ENO 1与HCMV UL55相互结合的蛋白条带。成功地筛选出10种与UL55蛋白相互结合的宿主蛋白,GST pull-down实验进一步表明ENO 1可以与HCMV UL55蛋白直接结合,为进一步研究UL55蛋白的功能提供了新的线索。

染色质解旋酶DNA结合蛋白7表达与肝癌临床病理特征及预后的关系

目的通过研究肝癌组织内染色质解旋酶DNA结合蛋白7(CHD7)的表达及其与肝癌患者临床病理特征及预后的关系,探讨CHD7作为肝癌预后预测指标的可行性。方法将286例肝切除术后病理确诊为肝细胞肝癌的标本制作成组织芯片。采用免疫组化法检测肝癌及癌旁肝组织中CHD7的表达水平,分析其与肝癌患者临床病理特征及预后之间的关系。结果免疫组化结果显示CHD7在肝癌组织中表达明显高于对应的癌旁肝组织。CHD7高表达与肿瘤数目、肿瘤包膜完整性、肿瘤血管侵犯、TNM分期及BCLC分期密切相关,与肝癌患者术后总体生存率呈负相关,而与肝癌患者术后复发率呈正相关。结论 CHD7在肝癌中明显高表达,可作为肝癌患者预后的独立预测指标之一。