松乳菇Lactarius deliciosus与红汁乳菇L. hatsudake子实体内可培养细菌多样性的研究

分离松乳菇Lactarius deliciosus与红汁乳菇L.hatsudake子实体内可培养的细菌,进行分类鉴定,为后期细菌与乳菇的相互作用研究奠定基础。利用传统平板法分离培养乳菇子实体内的细菌,进行16S r DNA片段的扩增和测序及系统发育树的构建和物种多样性分析。从松乳菇中获得66株细菌,红汁乳菇中获得48株细菌。松乳菇子实体内细菌隶属于3个门6个属10个种,其中变形菌门的γ-变型菌纲为优势类群,占细菌总数的77.28%,β-变形菌纲的Pandoraea和拟杆菌门的金黄杆菌属Chryseobacterium分别占细菌总数的12.12%和10.6%。红汁乳菇子实体内共分离、鉴定出细菌3个门7个属7个种,其中变形菌门中的γ-变型菌纲为优势类群,占细菌总数的77.09%,厚壁菌门的芽胞杆菌属Bacillus和拟杆菌门的金黄杆菌属Chryseobacterium分别占细菌总数的14.58%和8.33%。松乳菇与红汁乳菇子实体内存在一定种类和数量的细菌,其中荧光假单胞菌Psedomonas fluorescens和美洲爱文氏菌Ewingella americana为优势细菌。

松乳菇菌丝生长促生细菌的筛选与鉴定

[目的]从乳菇(Lactarius sp.)菌柄基部土壤分离并筛选出对松乳菇菌丝生长有促进作用的细菌(MHB),以提高松乳菇菌根苗人工合成效率。[方法]从乳菇菌柄基部土壤分离得到细菌,将纯化后的细菌液体培养离心后获得胞外代谢产物,以添加不同菌株和不同浓度胞外代谢产物的PDA培养基接种松乳菇菌丝块,并以未添加胞外代谢产物PDA平板接种松乳菇菌丝为对照,比较25℃培养30 d后松乳菇菌丝生长的直径大小和菌丝密度;另一方面,基于形态特征和16S rDNA序列鉴定对松乳菇菌丝生长有促进作用的细菌。[结果]共筛选出3株可促进松乳菇菌丝生长的芽胞杆菌属细菌,即菌株L1、L2和L3。当3株菌株的胞外代谢产物添加量为2.5%时,均能显著促进松乳菇菌丝生长,其菌落直径分别增加33.6%、55.6%和75.4%。当3株菌株胞外代谢产物以不同组合等比例混合后,在混合物添加量为5.0%时,L1-L3,L1-L2-L3两个组合显著促进松乳菇菌丝生长,松乳菇菌丝直径分别增加36.9%和42.5%。L3菌株的胞外代谢产物在添加量为2.5%、5.0%和7.5%时均能增加松乳菇菌丝密度,且添加量为7.5%时增加松乳菇菌丝密度效果最佳;L1-L3和L1-L2-L3两个组合也能增加松乳菇菌丝密度。通过对3株菌株形态特征鉴定和16S rDNA序列测定,L1菌株为高山芽孢杆菌(Bacillus altitudinis),L2菌株为蜡样芽胞杆菌(B.cereus),L3菌株为环状芽孢杆菌(B.zanthoxyli)。[结论]筛选出3株可促进松乳菇菌丝生长的芽孢杆菌,其中B.zanthoxyli促进松乳菇菌丝生长效果最好。

松乳菇外生菌根对马尾松幼苗生长的影响分析

为研究松乳菇外生菌根对马尾松幼苗生长的影响。以半年生马尾松幼苗为研究对象,对接种松乳菇菌根的马尾松幼苗的苗高、地径、冠幅、菌根依存度、根系活力、生物量、氮磷钾含量等方面进行分析。结果表明,马尾松对菌根依赖性较强,接种组马尾松幼苗的生长及根系活力均得到了提高,同时,马尾松幼苗根干重、茎干重、叶干重及生物量干重都有显著增加(P<0.05)。对于马尾松幼苗营养吸收方面的影响,氮素含量影响较小,磷素含量和钾素含量显著提高(P>0.05)。因此,松乳菇外生菌根可促进马尾松幼苗生长,具有推广价值。

松乳菇组织分离菌株的rDNA ITS序列分子鉴定

对松乳菇子实体和组织分离菌株rDNA ITS区域进行测序分析,通过和GenBank中已知的乳菇属的种进行序列比对,构建系统发育树,通过树图分析,鉴定出分离菌株就是松乳菇的纯菌种。

松乳菇多糖刺激免疫细胞增殖及诱导肿瘤细胞凋亡的研究

为研究松乳菇多糖(Lactarius deliciosus Gray polysaccharide,LDG-A)对特异性免疫细胞的增殖效应活性及对肿瘤细胞凋亡的影响,在LDG-A作用下检测T淋巴细胞、B淋巴细胞的增殖效应,并观察T淋巴细胞、B淋巴细胞的细胞形态,检测T淋巴细胞、B淋巴细胞在LDG-A的作用下处于细胞周期各个时期的细胞数量及B淋巴细胞分泌抗体的情况,观察LDG-A作用于肺癌细胞A549的凋亡和细胞骨架情况。结果表明:随着LDG-A质量浓度的增加,能够促进T淋巴细胞、B淋巴细胞的增殖,并呈现出一定的剂量依赖关系;同时LDG-A能够减少T淋巴细胞、B淋巴细胞在G0/G^1期的细胞数量百分比,促进细胞进入G^2/M期,具有促进B淋巴细胞分泌抗体免疫球蛋白M、免疫球蛋白D和免疫球蛋白E的作用。在12.5~50.0μg/m L范围内,LDG-A能够诱导肺癌细胞A549凋亡,并呈现出一定的剂量依赖关系;在细胞凋亡时F-肌动蛋白丝断裂,蛋白纤维网络结构被破坏。综上所述,在体外实验中,LDG-A对特异性免疫细胞具有促增殖效应活性,能够促进肿瘤细胞的凋亡。

野生松乳菇和野生红汁乳菇蛋白多糖的研究

选用合适的溶剂、方法、条件从野生松乳菇和野生红汁乳菇中提取蛋白多糖。粗多糖经Sevage法脱游离蛋白、DEAE-纤维素柱、SephadexG100柱层析分离、纯化,纯化的蛋白多糖进行紫外及红外光谱分析并测定蛋白质、多糖的含量及抗氧化能力。结果表明,松乳菇蛋白多糖中蛋白质和多糖含量分别为24.53%和68.83%;红汁乳菇中分别为15.53%和66.52%,两蛋白多糖均具有体外抗氧化的能力。经鉴定松乳菇蛋白多糖中单糖组成主要是葡萄糖、果糖和甘露糖,红汁乳菇蛋白多糖中单糖组成主要是葡萄糖、果糖和半乳糖。

松乳菇营养成分分析及松乳菇多糖的提取分离

以野生鲜松乳菇子实体、发酵所得菌丝体为材料,对其粗蛋白、氨基酸、脂类总量、多糖、灰分及微量元素的含量进行测定,并以正交法确定了松乳菇多糖提取的最佳工艺条件,以层析法定性分析了多糖的组成。

碳、氮和磷对松乳菇生长及矿质营养的影响

选用L9(34)正交表,设置了碳源、氮源和磷量的三因素三水平试验,以探索适于松乳菇生长和矿质营养吸收的最佳培养基。结果表明:9种培养基对松乳菇生长和矿质养分含量均有明显影响。三因素中,对菌丝体生长、K、Ca吸收影响最大的是碳源,对Fe、Mn吸收影响最大的是氮源,对P、Mg、Zn吸收影响最大的是P量。碳源中,可溶性淀粉效果最佳,可使生物量增加32.20%,P、K、Zn含量分别增加16.94%、182.81%,59.09%;氮源中,酒石酸铵最利于菌丝体生长,尿素最利于P、K吸收,谷氨酸最利于Mg、Fe、Mn吸收;P量中,0.5 g/L KH2PO4最适于菌丝体生长和对P、K、Mg、Zn的吸收。促进松乳菇生长和矿质营养吸收的优化组合是:可溶性淀粉18.0 g/L+酒石酸铵0.5 g/L+KH2PO40.5 g/L。

野生松乳菇菌种分离与培养特性的研究

以新鲜野生松乳菇子实体为材料,分别取其组织和孢子进行菌种分离,获得纯菌株。经固体培养和液体培养研究其人工培养特性,得知:以葡萄糖和蔗糖为碳源,蛋白胨或硝酸钾为氮源,pH7.5～8,26℃等条件下菌丝生长很旺盛,但不形成子实体。当以松树锯木屑或湿松树根或锯木屑加糖为培养料,并在恒温(25℃)、恒湿(95%)、光照培养条件下,不仅菌丝生长旺盛,而且能长出大拇指大小的菌蕾。

松乳菇液态发酵工艺及其饮料配方的研究

以新鲜野生松乳菇子实体为菌源,采用真菌组织分离法,获得纯菌丝体.利用麸皮、米糠、马铃薯等为主料进行液态发酵,采用正交试验法对培养基配方与饮料配方进行了研究.结果表明,最佳培养基配方为麸皮汁4%,葡萄糖4%,蔗糖3%,马铃薯汁25%,米糠汁5%,KH2PO40.3%,MgSO4·7H2O0.15%;最佳起始pH值为8.0;最佳发酵温度为26℃.最佳松乳菇发酵饮料配方为柠檬酸0.2%,苹果酸0.08%,白砂糖8%,蛋白糖0.04%,果胶0.1%,CMC Na0.2%.饮料成品的口感、风味、状态等均佳.

松乳菇菌丝深层培养营养因子及发酵条件研究

研究了松乳菇深层培养所需的碳源、氮源、矿质元素和维生素等营养因子 ,以及发酵的温度和pH值。实验表明 :松乳菇在以蔗糖、甘露醇、葡萄糖为碳源的培养基上启动最快 ,而在以蔗糖、糊精、葡萄糖为碳源的培养基上菌丝的生物量高 ,分别为 3 42mg 10 0mL ,3 3 2mg 10 0mL ,3 2 4mg 10 0mL ;氮源以牛肉膏最佳 ,菌丝生物量为 3 3 2mg 10 0mL ;矿质盐MgSO4和NaCl使松乳菇菌丝启动加快 ,磷酸二氢钾则使菌丝产量最高 ;VB1 、VB6对菌丝的起始生长有促进作用 ,烟酸对菌丝的后期生长速度加快 ;菌丝生长较适宜的温度范围是 2 5～ 2 7℃ ,最适宜的温度是 2 7℃ ;喜中性的生长环境 ,pH6～ 7.5范围内生长较好 ,最适pH值是

松乳菇多糖抗肿瘤和免疫调节活性研究

为探讨松乳菇(Lactarius deliciosus)多糖纯品的抗肿瘤活性和免疫调节活性,采用腹腔注射给药测定昆明种小鼠抑瘤率和脏器指数,采用MTT法测定肿瘤细胞生长抑制率及肝细胞增殖率,用倒置显微镜观察肿瘤细胞的生长情况。结果表明:在体内,松乳菇多糖能够显著抑制移植性肿瘤S180的生长,并呈一定的剂量依赖关系;14和28mg/kg.d的抑瘤率分别为48.71%和68.51%,且对小鼠脏器均无明显的损伤和毒副作用。在体外,松乳菇多糖可促进免疫细胞增殖,其对人正常肝细胞增殖的促进能力与浓度呈正相关。在一定范围内,松乳菇多糖可抑制肿瘤细胞增殖,并与剂量成正比,且作用于不同的肿瘤细胞有不同的效果。松乳菇多糖在高剂量时对人喉癌Hep-2的抑制作用较好,给药浓度为600μg/mL时,其最高抑制率达50.8%;而松乳菇多糖在低剂量时对人肝癌HepG-2有一定的抑制作用,给药浓度为150μg/mL时,其最高抑制率达32.76%。

松乳菇多糖对人喉癌Hep-2细胞肿瘤相关基因转录的影响

运用基因芯片技术分析松乳菇多糖对人喉癌Hep-2细胞肿瘤相关基因表达的影响及分子机制。结果表明,经松乳菇多糖600μg/m L处理48 h后,在人喉癌Hep-2细胞中发现相关肿瘤差异基因共68个,其中人喉癌Hep-2细胞肿瘤相关基因下调倍数大于100倍的基因共8个,下调50~100倍的基因共14个,同时按基因转录水平将这些基因进行了分类。运用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析技术分析相关基因通路,结果显示松乳菇多糖主要抑制人喉癌Hep-2细胞中的MAPK信号转导通路和PI3K-AKT信号转导通路。在松乳菇多糖的刺激作用下,人喉癌Hep-2细胞的凋亡是多种基因共同作用的综合结果。用筛选出的基因进一步研究肿瘤凋亡的分子机制,对寻找潜在的抗肿瘤作用靶点具有重要生物学意义。

松乳菇菌丝体固体平板培养的研究

由松乳菇子实体经组织分离得到纯化菌丝体,对其在固体平板培养基上进行培养,结果表明松乳菇菌丝体生长的适宜条件是PDA培养基、温度28℃、培养基pH5、无光照培养。研究发现添加马尾松不同组织的提取液对菌丝生长无明显影响。

松乳菇菌种分离及菌丝生长特性的研究

采用5种培养基配方,对2种不同颜色6个不同来源的松乳菇子实体的不同部位进行组织分离,发现分离松乳菇较好的培养基是PDA培养基,筛选出8株生长较好菌株。对菌株A1进行生长特性研究表明:菌株A1碳源利用范围广,蔗糖最好,葡萄糖次之,果糖最差;对氮源的利用,有机氮单一氮源优于复合氮源,其中尿素不能利用;无机氮源铵态氮优于硝态氮,以硫酸铵效果最好,亚硝酸盐不能利用;对盐浓度适应能力很强,在盐浓度为14g·L-1条件下也具有生长能力,适宜生长的盐浓度范围为0～6g·L-1。生长温度范围为7～37℃,适宜的生长温度是15～30℃,最佳生长温度是27℃。喜中性偏酸性环境,适宜生长的pH值为5～7,最适pH值为6 5。

松乳菇菌丝体胞内多糖与胞外多糖体外抑菌试验

试验测定了松乳菇菌丝体胞内多糖与胞外多糖对大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌、巴氏杆菌常见5种病源菌的体外抑菌效果,结果表明:两种多糖对葡萄球菌、链球菌抑菌效果不明显,胞内多糖对大肠杆菌效果也不明显,胞外多糖和胞内多糖对沙门氏菌的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)分别为:胞外多糖是25和150mg/ml,胞内多糖是50和200mg/ml;对大肠杆菌的MIC和MBC分别为:胞外多糖50和100mg/ml;对巴氏杆菌的MIC和MBC分别为:胞外多糖12.5和50mg/ml,胞内多糖100和150mg/ml。

氮源对松乳菇生长及氮吸收和硝酸还原酶活性影响

在供应氨态氮(NH4+-N)和硝态氮(NO3--N)的条件下,试验研究松乳菇(Lactarius delicious)3个株系(Ld-1,Ld-2,Ld-3)的生长、氮吸收和硝酸还原酶(NR)活性。结果表明,供应NO3--N和供应NH4+-N相比,前者使外生菌根的生长量显著增加,NR活性显著提高,但菌丝含氮量显著降低。此外,供应NO3--N,Ld-1和Ld-3的吸氮量显著高于供应NH4+-N;Ld-2则相反。说明松乳菇均能够吸收利用NH4+-N和NO3--N,土壤中的NO3--N适宜松乳菇生长,也可能有益于它们感染寄主植物形成外生菌根。

松乳菇ITS序列比较及其在乳菇属中的系统发育分析

提取江苏、云南、江西、湖南、广西、安徽、湖北地区的松乳菇(Lactarius deliciosus)、红汁乳菇(L.hatsudake)、橙色乳菇(L.akahatsu)和鲑色乳菇(L.salmonicolor)共25个子实体样本的基因组DNA,扩增ITS序列,对GenBank下载和本次及以前测序的松乳菇ITS序列的碱基组成、变异位点及碱基替换类型进行分析,从GenBank下载乳菇属其它8个种,构建乳菇系统发育树。结果显示:松乳菇ITS序列共有20 bp长度的变化,碱基C、T含量大于G、A含量。变异位点ITS共有99个(ITS1 58个、5.8S 4个、ITS2 37个),其中主要是T与C的转换,转换与颠换位点数分别为8和5。ITS1、5.8S、ITS2中转换与颠换的比值R分别为2.34、1.95、1.12。基于ITS序列计算不同地区松乳菇间的遗传距离,江西与意大利、西班牙,法国与西班牙序列间的遗传距离最大为0.012,云南和法国序列间遗传距离为0,是同源序列。系统发育树显示:松乳菇和红汁乳菇、橙色乳菇亲缘关系较近。

松乳菇研究进展

松乳菇是一种外生菌根真菌,人工栽培还未成功。介绍了松乳菇的生态环境,营养和功能,生物学特性以及人工栽培的情况。

碳源和氮源对松乳菇菌丝生长的影响

研究了影响松乳菇菌丝生长的碳源和氮源。结果表明 ,松乳菇的最适碳源是可溶性淀粉 ,最适氮源是蛋白胨和KNO3。