一种高效扩增血清松弛环状乙型肝炎病毒DNA全长基因组方法的研究

目的建立基于滚环复制的、高效扩增血清松弛环状乙型肝炎病毒DNA（HBV RC-DNA）全长基因组的方法。方法以60例慢性乙型肝炎患者血清HBV RC-DNA为研究对象,利用T4 DNA polymerase和T4 DNA ligase,封闭HBV RC-DNA基因组上的缺口,使之成为闭合环状结构;再通过Phi29 DNA polymerase的作用,对闭合环状的HBV基因组进行滚环复制,以滚环复制后的RC-DNA为模板扩增HBV全长基因组。结果成功建立了基于滚环复制的HBV RC-DNA全长基因组扩增方法,可从病毒载量为108~104拷贝/ml样本中扩增出HBV全长基因组。对于107~105拷贝/ml血清样本来说,使用基于RC-DNA滚环复制的全长基因组扩增方法,与以往的一步法扩增相比,扩增效率显著提高。结论基于滚环复制的HBV RC-DNA全长基因组扩增方法具有较高的灵敏度。该方法的建立为HBV全基因组研究提供了一种新的、有效的工具,有望在基础和临床研究中广泛应用。

环介导等温扩增(LAMP)试剂盒检测石蜡包埋肝组织中乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)

目的建立一种检测石蜡包埋的肝组织中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的新方法,并探讨其应用价值和临床意义。方法提取30例慢性HBV感染患者的石蜡包埋肝组织中的DNA,采用质粒安全ATP依赖性DNA酶(plasmid-safe ATP-dependent DNase,PSAD)消化,去除非cccDNA后,加入引物及Bst DNA酶进行环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),将检测结果与临床实验室资料结合并进行分析,以判断其临床应用价值。结果 30例HBV感染患者中,有17例HBV cccDNA阳性,阳性检测率56.67%。其中肝癌5例、肝硬化4例、重型乙型肝炎5例、慢性乙型肝炎(轻-中度)3例。提示肝组织HBV cccDNA阳性可能与疾病进展密切相关,与血清HBV cccDNA阳性有一定的相关性,与乙型肝炎病毒血清免疫标志物以及肝功能状况无明显相关。结论 LAMP法能检测到石蜡包埋肝组织中的HBV cccDNA,结合临床实验室资料,对判断抗病毒药物疗效及研究乙型肝炎致病机制具有一定的意义。

原位聚合酶链反应检测肝细胞内乙型肝炎病毒共价闭合环状的DNA表达

目的探讨乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(HBV-cccDNA)在慢性乙肝患者肝细胞中的表达及意义。方法选取活动性乙型肝炎及乙型肝炎后肝硬化患者肝穿或重症乙肝患者尸检肝组织标本50例,经10%甲醛固定,石蜡包埋,连续切片,用0.05%多聚赖氨酸处理后使用。分别设立无引物、无地高辛标记引物、无TaqDNA聚合酶PCR反应体系及非乙肝患者肝组织共10例作为阴性对照。采用原位PCR技术进行HBV-cccDNA检测。结果HBV-cccDNA在乙肝患者肝细胞中阳性表达以核型为主,呈蓝紫色,在肝细胞中总阳性表达率为60%～85%;偶见于细胞浆中,对照组均为阴性。结论原位PCR可以在肝细胞原位检测出HBV-cccDNA,阳性信号以核型为主,提示HBV-cccDNA主要存在于细胞核中,为乙肝病毒持续感染及复制的根源。

HBV pgRNA联合cccDNA对慢性乙型肝炎患者抗病毒疗效的预测价值

目的探究乙型肝炎(HBV)前基因组RNA(pgRNA)联合共价闭合环状DNA(cccDNA)对慢性乙型肝炎(CHB)患者抗病毒疗效的预测价值。方法收集2019年8月至2022年8月期间于本院进行抗病毒治疗的96例CHB患者的临床资料,根据患者治疗48周后是否获得完全应答分为完全应答组(78例)及非完全应答组(15例)。检测患者不同时间HBV cccDNA和HBV pgRNA水平,Logistic回归分析影响CHB患者获得完全应答的因素,并应用受试者工作特征(ROC)曲线分析pgRNA与cccDNA联合检测在抗病毒疗效的预测价值。结果96例患者中78例抗病毒治疗后获得非完全应答;完全应答组治疗24、48周HBV pgRNA、HBV cccDNA水平均低于非完全应答组(P<0.05);Logistic回归分析显示,治疗24周HBV pgRNA、HBV cccDNA高水平及治疗前ALT低水平是影响CHB患者抗病毒治疗无效的独立危险因素(P<0.05);经ROC分析显示,HBV pgRNA预测CHB患者抗病毒疗效的AUC值为0.618,95%CI为0.513~0.716,HBV cccDNA预测的AUC值为0.667,95%CI为0.561~0.760,二者联合预测的AUC值为0.881,95%CI为0.799~0.938。结论HBV pgRNA与cccDNA在CHB患者抗病毒治疗中下调,且治疗24周HBV pgRNA联合cccDNA检测对CHB抗病毒疗效具有更高的预测价值。

靶向核定位序列siRNA对乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA复制的抑制作用

目的针对乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白羧基端核定位信号(NLS)区设计并化学合成2条小干扰RNA(siRNA),观察其对共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)水平的影响。方法将siRNA转染可稳定分泌HBV颗粒的HepG2.2.15细胞,转染后72 h,采用ELISA方法检测上清液中HBsAg、HBeAg的含量,采用Real-time PCR定量检测细胞内cccDNA及细胞培养上清HBV DNA拷贝数。RT-PCR检测靶基因mRNA的抑制效果。结果靶向NLS区的2条siRNA均能不同程度地降低HepG2.2.15细胞cccDNA水平,抑制HBV DNA的复制及HBeAg的分泌,对cccDNA的抑制率分别为93.30%和85.00%(P<0.01),对HBV mRNA抑制率分别为62.80%和48.90%,对HBV DNA抑制率分别为76.56%和66.41%(P<0.01),对HBeAg抑制率分别为57.25%、43.48%(P<0.01)。而无关序列对HBV DNA与cccDNA的复制和HBeAg表达几乎无干扰作用。结论靶向HBV核心蛋白C末端核定位序列的siRNA可特异、高效、稳定地显著降低HBV cccDNA水平,抑制HBV DNA复制及HBeAg分泌,为应用RNA干扰治疗HBV感染奠定了一定基础。

利用乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA构建慢性乙型肝炎病毒感染的小鼠模型

目的通过水动力法注射乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)构建C57BL/6小鼠慢性乙型肝炎病毒感染的模型。方法取29只C57BL/6小鼠,分为实验组、对照组和空白组,应用水动力法分别注射HBV cccDNA、pAAV-HBV1.2及等渗盐水,于注射后收集不同时间点的血清和肝组织。利用放射免疫法检测血清样本中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg);荧光定量PCR检测血清和肝组织中HBV DNA拷贝数;免疫组织化学法检测肝组织中HBsAg和乙型肝炎病毒核心抗原(HBc Ag)的表达;苏木精-伊红(HE)染色观察肝组织病理变化;使用SPSS 17.0对数据进行统计学分析。结果实验组HBsAg和HBeAg表达均呈现4个上升-下降曲线:HBsAg峰值分别出现在第3天、第3周、第7周和第9周;HBeAg峰值分别出现在第1天、第1周、第4周和第10周。对照组HBsAg和HBeAg表达分别呈现2个或3个明显的峰:HBsAg峰值分别出现在第3天和第8周;HBeAg峰值分别出现在第1天、第3周和第10周。空白组未检测出HBsAg和HBeAg。实验组HBV DNA拷贝数高于对照组的拷贝数(P<0.01);肝组织中HBV DNA拷贝数高于同期血清中的拷贝数(P<0.01);实验组和对照组的肝组织中均有HBsAg和HBc Ag的表达;实验组与对照组出现肝脏细胞炎症、肝细胞纤维化、肝细胞坏死等病理变化,而空白组正常。结论利用水动力法向C57BL/6小鼠体内转入HBV cccDNA,成功建立了慢性乙型肝炎病毒感染的小鼠模型,与对照组比较,新建立的小鼠乙肝模型具有更高的HBV表达,动物模型为研究乙型肝炎病毒HBV cccDNA的感染及其引起肝损伤的机制奠定了基础。

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA研究进展

共价闭合环状DNA(cccDNA)是乙型肝炎病毒的原始复制模板,对乙型肝炎病毒的复制具有重要的意义,药物难以清除。近年来,国内外对cccDNA的研究取得了新的进展,学者们对不同标本中cccDNA的检测,及临床上对cccDNA的清除等进行了广泛的研究。现就有关乙型肝炎病毒cccDNA方面的研究进展予以综述。

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的研究现状

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）在病毒持续感染、停药后复发及药物抵抗等方面起关键的作用。本文对cccDNA形成机制、代谢调控、研究模型、检测方法和临床应用进行了简要综述。

应用微环DNA技术体外诱导和制备重组的乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)是病毒慢性感染的分子基础。本课题组前期研究通过Cre/loxP介导的位点特异性DNA重组策略,在细胞核内由前体质粒诱导重组cccDNA(rcccDNA^(loxP))产生,首次建立了HBV cccDNA的体外培养细胞和小鼠实验模型。本研究基于大肠埃希菌ZYCY10P3S2TPhiC31重组酶诱导表达系统,建立了一种体外诱导HBV rcccDNA(rcccDNAattR)微环产生和纯化的策略。纯化的rcccDNA^(attR)微环具有超螺旋结构,细胞培养实验证实其能支持功能性的HBV复制和抗原表达。与普通的线性HBV复制子编码质粒相比,rcccDNA^(attR)尾静脉高压注射小鼠模型能诱导显著延长的病毒抗原血症。因此,本研究在原核表达系统和实验小鼠水平提供了一种更为简化的HBV cccDNA实验模型系统,并再次显示rcccDNA具有显著的稳定性,能作为一种基本策略在小鼠模型中诱导病毒持续感染。

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA

HBV共价闭合环状脱氧核糖核酸（cccDNA）是嗜肝 DNA病毒基因组的复制中间体，是嗜肝 DNA 病毒部分基因的mRNA和前基因组 RNA的合成模板，在 HBV感染初期即能检测到，且长期存在于细胞核中。其在 HBV 复制过程中起着关键的作用，它的长期存在也是乙型病毒性肝炎慢性化的主要原因之一。HBV cccDNA肝细胞中持续感染及抗病毒治疗复发之间的关系受到广泛的关注与肯定，现就 HBV cccDNA 常用检测方法及其临床意义作一综述。

两种抽提乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA方法的效果比较

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)作为一种嗜肝DNA病毒,在感染肝细胞后会在细胞核中形成病毒转录复制的模板和基因储存库——共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA),其持续存在是乙型肝炎慢性化和难以治愈的核心,也是此研究领域内的重点。从细胞样品中稳定抽提获取cccDNA对于保证cccDNA检测的准确性至关重要。Hirt法是一种抽提真核细胞染色体外DNA的方法,被用于HBV cccDNA的抽提,但存在操作复杂和耗时长等问题。为简化操作,有研究对Hirt法进行改良,结合硅胶膜离心柱来抽提染色体外DNA,但尚不清楚该法用于HBV cccDNA抽提与传统Hirt法的效果差异。本研究基于HBV cccDNA细胞转染系统、HBV复制细胞系及感染系统,以DNA印迹(Southern blot)和定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)作为检测评价手段,平行比较了传统Hirt-酚/氯仿法与改良Hirt-过柱法抽提HBV cccDNA的效果。结果表明,两种方法具有相当的抽提效率和抽提特异性,而改良Hirt-过柱法耗时更短,提示在进行细胞HBV cccDNA抽提时可选择改良Hirt-过柱法以提高实验效率。

乙型肝炎病毒感染相关性肝癌中HBV cccDNA水平与突变关系的研究

目的:研究乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染相关性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中HBV共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,ccc DNA)水平与突变关系。方法:运用特异性荧光定量PCR定量分析了12例肝癌组织和癌旁组织中乙肝病毒复制水平的表征因子HBV ccc DNA,HBV total DNA及前基因组RNA(pregenome RNA,pg RNA)的表达水平,再用滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)特异性扩增癌组织中HBV ccc DNA,测序分析了病毒基因组4个编码调控区域pre C/C、RT、X、pre S中ccc DNA序列的突变。最后检测了肿瘤组织ccc DNA的AP位点。结果:HBV ccc DNA在癌组织的表达水平明显低于癌旁组织(3.32 copies/cell vs.9.64 copies/cell,P=0.029),但是HBV总DNA和pg RNA的表达没有明显差异(16.94 copies/cell vs.12.18 copies/cell,P=0.325,75.54 copies/cell vs.22.46 copies/cell,P=0.128);在肝癌组织中,HBV ccc DNA pre C/C和X区间,G-A突变是主要的突变类型;其次,pre C/C和X区域发生G-A突变的位置上,均更倾向于GA二联核苷酸组合方式,在肝癌中所占比例为37.1%和40%。最后,肿瘤组织中APE1酶处理后,HBV ccc DNA水平明显下降(1 011 copies/μl vs.501.8 copies/μl,P=0.058)。结论:HBV ccc DNA水平在癌组织中明显低于癌旁组织,可能与癌组织中HBV ccc DNA发生大量GA突变及形成的AP位点有关。

乙型肝炎病毒相关性肾小球肾炎患儿血清中HBV-cccDNA水平检测及其临床意义

目的:分析血清中乙肝病毒共价闭合环状双链DNA (HBV-cccDNA)水平对乙型肝炎病毒相关性肾小球肾炎(HBV-GN)患儿肝肾功能、肾组织中HBV抗原的检出、肝组织病理分级和分期的影响,评价HBVcccDNA水平检测对HBV-GN患儿诊断的临床应用价值。方法:选取39例HBV-GN初治患儿作为研究对象(观察组),所有患儿均接受肝脏和肾脏穿刺;选取肝功能正常HBV携带患儿40例作为对照组。检测2组患儿丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平,采用PCR荧光分子信标技术检测患儿血清中HBV-cccDNA水平,HE染色检测患儿肝脏和肾脏组织的形态表现,免疫荧光法检测患儿肾组织中HBsAg、HBeAg和HBcAg检出率,采用受试者工作特征(ROC)曲线及曲线下面积(AUC)评价HBV-cccDNA水平检测在HBV-GN诊断中的价值。以HBV-cccDNA的Ax荧光值>21判定为阳性,反之判定为阴性,将HBV-GN患儿分为HBV-cccDNA阳性组(n=24)和HBV-cccDNA阴性组(n=15)。在抗病毒治疗后第2、4、8和12周时检测患儿血清中HBV DNA及HBV-cccDNA水平。结果:HBV-cccDNA阳性组患儿ALT和AST水平异常率、HBeAg和尿蛋白阳性率均高于HBV-cccDNA阴性组(χ~2=4.454,P=0.035;χ~2=5.912,P=0.022;χ~2=8.770,P=0.007)。HBV-cccDNA阳性和阴性组HBV-GN患儿肝组织炎症和纤维化程度比较差异无统计学意义(P>0.05),HBV-GN患儿肾脏活检病理类型以膜性肾病(MN)为主,HBV抗原成分以HBeAg及HBcAg为主,HBV-cccDNA阳性组患儿HBeAg及HBcAg检出率明显高于HBV-cccDNA阴性组(χ~2=5.652,P=0.027;χ~2=12.523,P=0.001)。ROC曲线评价,HBV-cccDNA水平检测能有效鉴别观察组HBV-GN患儿和对照组患儿,AUC=0.804 (95%CI:0.709~0.883)。10例规范治疗且有完整追踪治疗资料的HBV-GN患儿在治疗第2周时其HBV-cccDNA水平明显降低,治疗至第12周时其中7例患儿HBeAg转阴,无蛋白尿、血尿症状,ALT和AST水平均正常;治疗无效的3例患儿血清中HBV-cccDNA水平均高于其余7例标本。结论:HBV-cccDNA高表达与HBV-GN患儿肝功能、蛋白尿及肾脏HBV抗原检出有密切关联,检测HBVcccDNA水平对儿童HBV-GN患儿的辅助诊断及疗效评估具有潜在的临床应用价值。

乙型肝炎病毒cccDNA与HBx蛋白在肝细胞性肝癌中表达的关系及意义

目的:探讨肝细胞性肝癌中乙型肝炎病毒(HBV)cccDNA与HBx蛋白表达的关系及其意义.方法:取42例肝细胞性肝癌患者的癌和癌旁组织,采用SABC法检测组织中的HBx蛋白;采用RT-PCR法检测组织中的HBV cccDNA水平.结果:HBx蛋白在癌及癌旁组织中的阳性例数分别为31例(73.8%)和35例(83.3%),无显著性差异;癌旁组织中cccDNA水平较癌组织中的高,但是统计学检验无显著性差异;癌组织和癌旁组织中HBx蛋白(+)者的cccDNA水平均明显高于HBx蛋白(-)者(P<0.05).HBx蛋白表达与cccDNA水平呈正相关(r=0.778,P<0.01).结论:HBx蛋白的表达与cccDNA水平明显相关,他们相互作用、相互影响并在肝癌的发生发展中起重要作用.

乙型肝炎病毒cccDNA检测方法的建立及初步应用

目的:建立和应用聚合酶链反应法(PCR)检测慢性乙型肝炎患者肝组织中乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)。方法:应用选择性PCR的方法检测30例乙肝患者肝组织中cccDNA,同时验证此方法的特异性。结果:31例慢性乙型肝炎患者肝组织中,10例HBVcccDNA阳性,阳性率为32.3%。HBV cccDNA阳性组的ALT、HBVDNA、和HBeAg水平均明显高于阴性组(P<0.01和P<0.05)。结论:该方法操作简单,特异性好,可用于测定肝组织中HBV cccDNA,用于了解乙肝患者病情和传染性强弱以及评价抗乙肝病毒药物的疗效。

慢性乙型肝炎患者血清共价闭合环状DNA检测的临床意义

目的探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者血清中共价闭合环状DNA(cccDNA)的临床检测意义。方法随机选取进行肝组织活检的CHB患者57例。用实时荧光定量PCR法分别检测入选病例血清中cccDNA值,同时定量检测血清中HBV DNA水平,对比HBeAg阳性组和HbeAg阴性组cccDNA水平,并分析cccDNA与HBV DNA、病理炎症分级、ALT的关系。结果 HBeAg阳性组血清中cccDNA水平明显高于HBeAg阴性组(P<0.05);HBeAg阳性组血清中cccDNA与HBV DNA存在正相关关系(P<0.01);cccDNA水平和肝组织炎症活动度及ALT水平比较均无显著性差异(P均>0.05)。结论血清中HBV cccDNA定量是评价HBV复制最客观可靠的指标,在CHB诊断及抗病毒治疗中具有重要意义。

荧光PCR检测乙型肝炎病毒cccDNA方法的建立

目的:建立特异、灵敏的荧光PCR检测乙型肝炎病毒cccDNA的方法。方法:首先用煮沸法提取血清中的HBVDNA,然后用绿豆核酸酶(Mung Bean Nuclease)消化松弛环状HBVDNA(rcDNA),保留共价闭合环状DNA(cccDNA)。设计一条嵌合引物,该引物分为两部分序列,近5′部分为人为设定的序列,近3′部分是与正链缺口下游互补序列。先用该嵌合引物以正链为模板,自HBV cccDNA1590nt开始向上游延伸,然后以嵌合引物中人为设定的序列为下游引物、与负链互补的上游引物以及一条在两引物之间与正链互补的Taqman探针,扩增检测嵌合引物延伸的产物。由于带有缺口的HBV rcDNA无法被嵌合引物延伸,因此最终只能扩增检测到cccDNA。结果:用含有相应HBV DNA片端的PUC19质粒模拟HBV cccDNA,该检测方法的检测灵敏度为1×103拷贝/ml;以模拟松弛环状DNA(rcDNA)与模拟HBV cccDNA按不同比例混合,在rcDNA与cccDNA的比为1×109拷贝/ml:1×103拷贝/ml时,该方法仍可检测到模拟cccDNA;单独检测模拟rcDNA浓度为1×109拷贝/ml时,该方法检测未出现假阳性。结论:该检测乙型肝炎病毒cccDNA的方法操作简单、灵敏、特异,适用于检测血清中HBV cccDNA。

乙型肝炎病毒共价键闭环DNA的表观遗传调控研究进展

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染仍然是威胁全球人类生命与健康的重要危险因素。虽然目前的抗病毒治疗药物在控制乙型肝炎进展有显著疗效,但却始终无法达到根治HBV感染的目标。HBV共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)是HBV转录复制的原始模板,也是HBV持续感染的关键因素。但由于缺少有效的完全清除HBV cccDNA的治疗方法,慢性乙型肝炎患者需长期服药以防治疗后停药复发。研究证实HBV cccDNA的转录受表观遗传机制调控,其中cccDNA甲基化、组蛋白修饰、miRNA、染色质重塑等均影响HBV cccDNA的功能。本文就HBV表观遗传调控的最新研究进展进行综述。

抗病毒药物对乙型肝炎病毒cccDNA水平的影响

慢性乙型肝炎目前还是不能治愈的疾病,主要原因是由于干扰素和核苷(酸)类似物等抗病毒药物不能有效清除肝细胞内乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(hepatitis B virus covalently closed circular DNA,HBV c c c D N A),导致药物疗效不佳或治疗后复发.因此,进一步加强对HBV感染的基础和临床研究,以清除肝细胞内HBV ccc DNA为目标开发新药和探讨治疗策略是今后肝病研究领域的重要课题.本文从细胞、动物和临床研究水平,将近年来开展的影响HBV ccc DNA水平的多种药物和治疗方案进行综述,旨在为临床医师较为全面地了解清除HBV ccc DNA的研究现状提供参考.

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA清除的研究进展

乙型肝炎是感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)引起肝脏慢性炎症性改变为主要特征的一类传染病。长期慢性感染将导致肝纤维化、肝硬化、肝癌等终末期肝病的发生,严重危害人民群众的健康。慢性乙型肝炎病毒感染依然是全球公共卫生健康问题之一。目前临床上使用的抗病毒治疗方案难以实现对乙型肝炎病毒的彻底清除,其根源在于被感染肝细胞核内持续存在具有稳定结构的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)。本文对乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA清除的研究进展进行综述,旨在寻找清除cccDNA的途径及办法从而达到乙型肝炎病毒的彻底清除。