松毛虫质型多角体病毒RT-PCR检测技术的建立

为研究DsCPV在松毛虫种群中的垂直传递及对松毛虫灾害的持续控制作用 ,通过反转录聚合酶链式反应 (RT PCR)建立了DsCPV的早期检测技术。依据家蚕质型多角体病毒 (BmCPV)质型多角体蛋白的核苷酸序列设计一对引物 ,从纯化的DsCPV、BmCPV和舞毒蛾质型多角体病毒 (LdCPV)的基因组dsRNA可成功地扩增出长 6 14bp的目的片段 ,从提取的健康松毛虫幼虫肠组织的DNA、舞毒蛾核型多角体病毒 (LdNPV)基因组核酸、以及棉铃虫质型多角体病毒 (HaCPV)基因组核酸 ,未能扩增出目的片段。DsCPV基因组dsRNA扩增片段的序列与BmCPV相应基因序列具有 87%的同源性 ,检测敏感度为 1pg的DsCPV基因组dsRNA。由于松毛虫与家蚕、舞毒蛾相互之间食性不同 ,而且BmCPV和LdCPV对松毛虫无感染性 ,即在松毛虫体内不会有Bm CPV病毒和LdCPV病毒的感染 ,因此该结果一方面从分子水平上证实了DsCPV与BmCPV、LdCPV存在基因同源性 ,同时也表明了依据BmCPV的基因序列设计引物对DsCPV基因组核酸建立的RT PCR扩增体系 ,可以作为松毛虫种群中DsCPV的一种敏感、特异、早期、快速的检测手段。

马尾松毛虫质型多角体病毒S4的cDNA克隆及序列分析

从马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株中提取病毒核酸,回收、纯化第四片段S4,经RT-PCR扩增得到了S4的cDNA克隆并测定了其全序列。结果表明,S4全长由3262个碱基组成,包含一个编码1058个氨基酸的完整开放阅读框架。Blast同源分析显示,DpCPV s4与LdCPV S4、BmCPV S4和RRSV S2编码蛋白氨基酸的同源性分别为94％、92％和22％。另外,氨基酸序列部分区域与Methanosarcina mazei Goel的甲基化转移酶有同源性,且序列中含有鸟苷酸转移酶活性位点。

家蚕对马尾松毛虫质型多角体病毒的敏感性

用虫体克隆技术 ,对马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株 (DpCPV HN)进行了分离纯化 ,鉴定为质型多角体病毒 1型。以家蚕春蕾×镇珠杂种F1 代及自交的F2 代 4或 5日龄幼虫进行毒力测定 ,以纯化的家蚕质型多角体病毒对F1 代幼虫的毒力测定为对照。结果表明 :家蚕品种春蕾×镇珠对家蚕质型多角体病毒敏感 ,马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株能引起其感染发病 ;马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株感染家蚕品种春蕾×镇珠F1 代幼虫和F2 代幼虫 2 8天后的半致死剂量(LD50 )分别为 885个和 18个CPB (质多角体 ) ,前者为后者的 4 9倍。马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株感染后的家蚕 ,其结茧率、化蛹率、羽化率、全茧量、茧层量和单蛾产卵数均有所下降 ,全茧量、茧层量、茧层率和单蛾产卵数与病毒感染剂量之间无显著关联。

影响棉铃虫增殖马尾松毛虫质型多角体病毒的条件因子的初步探讨

棉铃虫为马尾松毛虫多角体病毒 (DPCPV)理想的替代寄主。试验结果表明 ,不同接毒方法、接种浓度、接种温度及接种虫龄对棉铃虫增殖病毒有影响 ,以病毒涂在人工饲料表面的接毒方法、2 0～ 2 3℃温度及 3龄虫为最佳组合条件。由于利用棉铃虫生产出的病毒 (Ha DPCPV)容易诱发棉铃虫本身的多角体病毒 (NPV) ,尤其对那些带有NPV源的虫种 ,Ha DPCPV不宜作毒种 ,因此为慎重起见 ,最好用马尾松毛虫复制出的病毒作为生产毒种。

文山松毛虫质型多角体病毒在Sf21细胞中离体增殖试验

研究了文山松毛虫质型多角体病毒 (DpCPV W )在Sf2 1细胞中的离体增殖行为 ,并进行了空斑试验 ,结果显示DpCPV W毒株能够在Sf2 1细胞中增殖 ,也能在Sf2 1细胞上形成空斑 ,并能产生形态正常的病毒多角体。在DpCPV W中加入基因工程增效蛋白 ,能显著增加病毒粒子对离体细胞的感染率 ,增幅达 145 %。生物测定表明 ,离体增殖的病毒多角体与虫体增殖的多角体的毒力相当。因此 ,Sf2 1细胞可以作为文山松毛虫CPV增殖行为研究的离体细胞系统 。

马尾松毛虫质型多角体病毒NSP1蛋白在昆虫细胞表达及定位

马尾松毛虫质型多角体病毒(Dendrolimus punctatus cytoplasmic polyhedrosis virus,Dp CPV)基因组S5片段编码一个由881个氨基酸组成、分子量为101 k D的非结构蛋白(NSP1)。为探寻Dp CPV NSP1蛋白的功能,将Dp CPV 1基因组S5-1片段的抗原区(1-600 bp)进行了原核表达,并将纯化蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。将稀释后的病毒液感染甜菜夜蛾幼虫,感染后每天解剖甜菜夜蛾并取中肠样品,通过Western blot检测NSP1蛋白的合成时间曲线。Western blot检测结果显示,S5片段表达的蛋白在病毒感染第1天就有合成,并且除了检测到全长的蛋白(101 k D)外,也检测到了80 k D和20 k D的蛋白条带,说明NSP1蛋白为早期表达蛋白,并且蛋白发生了切割。另外,首次对Dp CPV 1 S5片段进行了在昆虫细胞中表达和昆虫亚细胞定位,结果显示,昆虫细胞定位于细胞的细胞质。

马尾松毛虫质型多角体病毒对棉铃虫生长发育的影响

为了弄清马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV)对棉铃虫生长发育的影响,利用带毒饲料饲喂棉铃虫幼虫的方法进行了试验观察,结果表明:马尾松毛虫质型多角体病毒对棉铃虫幼虫具有一定的侵染性;棉铃虫幼虫的死亡率随病毒浓度的升高而增大;蛹重和羽化率随病毒浓度的升高而减小;幼虫历期受到的影响不显著。利用马尾松毛虫质型多角体病毒防治棉铃虫具有较好的开发运用前景。

松毛虫质型多角体病毒油剂超低容量林间作业技术

文章以3WF-3S背负式喷雾喷粉机为施药器械,用松毛虫质型多角体病毒油剂进行超低容量喷雾,对流量、雾滴大小及密度和有效喷幅进行了测定,初步介绍了松毛虫质型多角体病毒油剂林间超低容量喷洒技术。

马尾松毛虫质型多角体病毒非结构蛋白p44在Bac-to-Bac系统中的表达和亚细胞定位

为探寻马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV 1)p44蛋白的功能,构建了DpCPV 1基因组S8片段的原核表达体系,表达纯化蛋白后免疫家兔制备了多克隆抗体。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,构建了3种重组的杆状病毒质粒(Bacmid-p44、Bacmid-p44-e GFP和Bacmid-e GFP)。转染昆虫细胞Sf9进行表达,通过Western blot检测和蛋白的亚细胞定位观察。Western blot检测结果显示,Bacmid-S8在昆虫细胞Sf9中表达实际蛋白的大小为35 kD,比在原核系统中表达的蛋白(44 k D)略小;利用激光共聚焦显微镜观察p44-e GFP的融合蛋白的亚细胞定位发现,融合p44的绿色荧光蛋白(eGFP)主要聚集在细胞质中,而未融合的eGFP则分布于整个细胞,说明DpCPV 1的p44蛋白定位于细胞质中。

马尾松毛虫质型多角体病毒多角体蛋白基因的表达与定位

为了表达马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV)多角体蛋白基因(S10片段)并探讨多角体蛋白在真核细胞中的定位,从DpCPV中分离出S10,与pET-28a载体连接成重组表达质粒pET28-S10;将S10克隆到杆状病毒转座载体pFASTBACHTb中,依次筛选出重组转座质粒pFASTBACS10,重组穿梭质粒BacmidS10,重组杆状病毒AcS10。多角体蛋白基因表达后,用SDS-PAGE、Western-blot和免疫荧光技术对表达产物进行了检测。结果表明:S10原核表达质粒、重组杆状病毒成功获得;在昆虫细胞中表达的质型多角体蛋白主要定位于细胞质,同时有少量产物定位于细胞核。

松毛虫质型多角体病毒油剂超低容量喷雾防治松茸毒蛾试验

用松毛虫质型多角体病毒油剂超低容量喷雾防治2～4龄松茸毒蛾幼虫,20d死亡率为47.7%～60.6%,存活幼虫感染率69.8%～84.6%,总防治效果85.1%～94.7%。相同病毒用量下的防治效果与常量喷雾相当或略好。合适的用量为1500×108～3000×108PIB/hm2,合适的喷幅为6～10m。

文山松毛虫质型多角体病毒技术

文山松毛虫质型多角体病毒技术中国文山松毛虫质型多角体病毒（简称Ｃｙ－ＤＰＷＣＰＶ），１９８３年云南省林科院森保所病毒组首次在云南石屏县坝心林区发现。经过十年林间推广运用的实践证明，Ｃｙ－ＤＰＷＣＰＶ是具有较强致病力和显著传代感染效果的一种生物杀虫剂。...

松毛虫质型多角体病毒(CPV)生产及应用技术探讨

文章对松毛虫质型多角体病毒 (CPV)生产中的增殖方式、接种浓度、复制世代、采收时机、切片次数、离心机进液速度及应用中的使用方式、防治时机进行了探讨 。

松毛虫质型多角体病毒林间增殖与提取技术初报

在林间喷施不同浓度的松毛虫质型多角体病毒(CPV)2.8×107PIB/ml、2.8×106PIB/ml、2.8×105PIB/ml15天后,调查结果表明:三种浓度的CPV感染马尾松毛虫后中肠发白率分别达到72.2%、69.2%、20.2%。林间给马尾松毛虫自然种群喷施2.8×106PIB/mlCPV增殖病毒,经济有效。开展了大规模CPV提取试验,提取的CPV制剂多角体达25.2×108PIB/g,病毒提取率6.8%。进行了CPV保存试验,试验表明低温有利于CPV保存。

松毛虫赤眼蜂携带质型多角体病毒防治马尾松毛虫

在湖南两个林场试验的结果显示，用携带松毛虫质型多角体病毒的赤眼蜂防治松毛虫比未携带病毒寄生蜂的防治效果要高。两者的防治效果分别为９４．１％～９７．３％和７４．６％～８１．２％。赤眼蜂对寄主卵的发育程度有明显的选择性，寄主卵发育超过３０小时的很少受赤眼蜂寄生。用携带病毒赤眼蜂传播病毒可以增加松毛虫的死亡率。用赤眼蜂传播病毒的方法比在林间喷洒病毒可节省大量的病毒剂。

马尾松毛虫质型多角体病毒结构蛋白的抗体制备及免疫性

质型多角体病毒的病毒粒子结构蛋白是由衣壳蛋白VP1(Capsid protein,CP)、塔状蛋白VP3(Turret protein,TP)和大突起蛋白VP5(Large protrusion protein,LPP)组成,这3个蛋白分别由病毒基因组片段S1、S4和S7编码.为了解质型多角体病毒结构蛋白的免疫定位情况,本研究从马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株中提取病毒核酸,回收、纯化S1、S4和S7片段,经RT-PCR扩增得到对应片段的ORF全长或抗原区的片段,克隆于原核表达载体上,在大肠杆菌BL21菌株中进行了表达,免疫家兔制备了多克隆抗体.Western blot结果显示DpCPV基因组的S1、S4和S7片段分别编码其结构蛋白VP1、VP3和VP5,与推测的结果一致.免疫胶体金的方法也证明S1、S4和S7编码的蛋白定位于病毒粒子衣壳的外表面.本研究首次通过免疫学方法确定了质型多角体病毒结构蛋白在病毒粒子上的定位,为质型多角体病毒的结构蛋白功能和侵染机制研究提供了免疫学方面的基础,对质型多角体病毒的研究有较重要的意义.

应用质型多角体病毒防治赤松毛虫林间试验

赤松毛虫严重危害油松、赤松、落叶松的正常生长,为了选择安全有效的防治方法,在林间开展赤松毛虫的防效试验。通过抽样调查卵期赤眼蜂寄生率、2龄幼虫病毒感染率、幼虫下树前死亡率和越冬后幼虫死亡率,对直接喷洒传递松毛虫质型多角体病毒(CPV)和利用赤眼蜂为媒介传递该病毒的防效进行比较。结果显示:赤松毛虫卵期赤眼蜂寄生率比对照提高25%左右。直接喷洒CPV病毒的防效要优于利用赤眼蜂携带CPV病毒进行防治的效果,2龄幼虫病毒感染率、幼虫下树前死亡率和越冬后幼虫死亡率分别提高20%、4.1%和4.0%,二者的防治效果,明显高于对照。

马尾松毛虫质多角体病毒NS5蛋白的表达和功能初步分析

马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株第9个片段编码非结构蛋白NS5,利用pET-32a(+)载体带有组氨酸标记的重组蛋白进行表达,获得纯化的重组蛋白。利用凝胶电泳阻滞检测试验(EMSA)检测蛋白和核酸的结合作用,结果表明NS5蛋白能与病毒基因组dsRNA结合。