利用棉铃虫为宿主增殖松毛虫质型多角体病毒

应用细胞质多角体病毒JDS-CPV在日本防治赤松毛虫(Dendrolimus spectabilis)以及在我国台湾省防治马尾松毛虫(D.punctatus)均取得较好的效果。自1983年以来,利用JDS-CPV在我国广东、云南、浙江、安徽等省防治松毛虫,也都具有很好的效果。JDS-CPV的复制,过去主要是利用林间的松毛虫。如何使之成为周期性的连续生产。

松毛虫质型多角体病毒的宿主域与交叉感染

自 1956年从赤松毛虫Dendrolimusspectabilis上首次发现赤松毛虫质型多角体病毒 1型 (D .spectabiliscytovirus 1,DsCPV 1)以来 ,先后从马尾松毛虫D .punctatus、油松毛虫D .tabulaeformis、赤松毛虫、德昌松毛虫D .p .tehchangensis、文山松毛虫D .p .wenshangensis和落叶松毛虫D .superans上发现了质型多角体病毒 (cytoplasmicpolyhedrosisvirus ,CPV)。病毒基因组dsRNA电泳图谱分析表明 ,这些松毛虫CPV的不同分离株均属于质型多角体病毒 1型 (cytovirus 1)。这些松毛虫CPV病毒可以感染鳞翅目 10科 3 5种昆虫 ,其中对多种昆虫具有很高的感染力和良好的杀虫效果 ,可以从中筛选替代宿主生产松毛虫CPV杀虫剂 ,用于害虫生物防治。松毛虫CPV接种某些昆虫后病毒的基因组dsRNA电泳图谱发生了改变 。

松毛虫赤眼蜂携带质型多角体病毒防治马尾松毛虫

在湖南两个林场试验的结果显示，用携带松毛虫质型多角体病毒的赤眼蜂防治松毛虫比未携带病毒寄生蜂的防治效果要高。两者的防治效果分别为９４．１％～９７．３％和７４．６％～８１．２％。赤眼蜂对寄主卵的发育程度有明显的选择性，寄主卵发育超过３０小时的很少受赤眼蜂寄生。用携带病毒赤眼蜂传播病毒可以增加松毛虫的死亡率。用赤眼蜂传播病毒的方法比在林间喷洒病毒可节省大量的病毒剂。

松毛虫质型多角体病毒RT-PCR检测技术的建立

为研究DsCPV在松毛虫种群中的垂直传递及对松毛虫灾害的持续控制作用 ,通过反转录聚合酶链式反应 (RT PCR)建立了DsCPV的早期检测技术。依据家蚕质型多角体病毒 (BmCPV)质型多角体蛋白的核苷酸序列设计一对引物 ,从纯化的DsCPV、BmCPV和舞毒蛾质型多角体病毒 (LdCPV)的基因组dsRNA可成功地扩增出长 6 14bp的目的片段 ,从提取的健康松毛虫幼虫肠组织的DNA、舞毒蛾核型多角体病毒 (LdNPV)基因组核酸、以及棉铃虫质型多角体病毒 (HaCPV)基因组核酸 ,未能扩增出目的片段。DsCPV基因组dsRNA扩增片段的序列与BmCPV相应基因序列具有 87%的同源性 ,检测敏感度为 1pg的DsCPV基因组dsRNA。由于松毛虫与家蚕、舞毒蛾相互之间食性不同 ,而且BmCPV和LdCPV对松毛虫无感染性 ,即在松毛虫体内不会有Bm CPV病毒和LdCPV病毒的感染 ,因此该结果一方面从分子水平上证实了DsCPV与BmCPV、LdCPV存在基因同源性 ,同时也表明了依据BmCPV的基因序列设计引物对DsCPV基因组核酸建立的RT PCR扩增体系 ,可以作为松毛虫种群中DsCPV的一种敏感、特异、早期、快速的检测手段。

文山松毛虫质型多角体病毒形态结构及理化性质的研究

对文山松毛虫质型多角体病毒的形态结构及理化特性进行了研究,多角体大部分为六边形,少数为四边形及近园形,其大小在0.47～2.45μ之间,平均为1.1μ。病毒粒子呈球形,无囊膜,致密的核芯区由一层外壳包裹,直径为60nm。病毒粒子表面有12个刺突,放大图象可见其亚单位排列。多角体蛋白的主要成分为一种,分子量为26200道尔顿,多角体蛋白氨基酸组成中不含半胱氨酸;其碱性氨基酸与酸性氨基酸之比为1:2.16。病毒粒子结构蛋白含五条多肽组分。用SDS-热酚法提取所得核酸,其热变性紫外吸收OD260值增加51.6％。抗核酸酶S1。Tm值为86℃。在1％琼脂糖凝胶电泳中可分为9个片段,而在5％PAGE中,则可分为10个片段。各片段大小在0.66×106～2.85×106道尔顿之间,总分子量为15.35×106。电镜分析研究显示了CPV RNA在0.4μ、0.8μ和1.2μ处有三个分布峰。

文山松毛虫质型多角体病毒(DpwCPV)多角体蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

通过对文山松毛虫质型多角体病毒的增殖 ,纯化 ,获得一株单一类型的质型多角体病毒 提纯的病毒粒子经SDS 酚抽提 ,琼脂糖凝胶电泳分离基因组dsRNA ,低熔点琼脂糖电泳法回收纯化编码多角体蛋白的第十片段S10 S10经DMSO变性 ,逆转录合成cDNA第一条链 ,PCR扩增后 ,克隆在PMD18 T载体上 ,克隆片段全长 76 3bp 起始密码AUG位于第 3～ 5位碱基 ,终止密码UGA位于第 74 7～ 74 9位碱基 推测DpwCPV多角体蛋白基因编码一段由 2 4 9个氨基酸组成的多肽 ,分子质量为 2 84 39.4 4× 10 3 与舞毒蛾质型多角体病毒 (LdCPV)多角体蛋白基因比较 ,两者核苷酸序列的同源性为 97% ,它们各自编码的多角体蛋白的氨基酸同源性为 99% ;与家蚕质型多角体病毒(BmCPV)多角体蛋白基因相比较 ,两者核苷酸序列的同源性为 88% ,它们各自编码的多角体蛋白的氨基酸同源性为 97%

甜菜夜蛾增殖马尾松毛虫质型多角体病毒研究

以甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)作为替代宿主增殖马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV)的研究结果表明,DpCPV在甜菜夜蛾体内连续传代3次后得到的DpCPV-Se3与DpCPV具有相同的电泳图谱;多角体和病毒粒子在电镜下观察,未发现形态上的明显变化.生测结果表明,DpCPV-Se3与DpCPV回接松毛虫试验,其半数致死浓度分别为0.92×103 PIB/mL和1.44×103PIB/mL,二者毒力差异不显著.以甜菜夜蛾增殖DpCPV,多角体产量达到2.34×108PIB/头.用DpCPV-Se3和DpCPV的S7和S10片段分别进行同源性序列分析,结果没有明显变化.认为利用甜菜夜蛾增殖DpCPV用于生物防治具有可行性.

马尾松毛虫质型多角体病毒多角体蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

通过对马尾松毛虫质型多角体病毒的增殖、纯化 ,获得一株单一类型的质型多角体病毒。提纯的病毒粒子经SDS-酚抽提 ,琼脂糖凝胶电泳分离基因组dsRNDA ,回收纯化第十片段S10。S10经DMSO变性 ,逆转录合成cDNA第一链 ,PCR扩增后 ,克隆在pGEM T载体上。对重组子进行限制性内切酶分析及序列测定 ,结果表明 ,克隆片段全长 76 3bp ,起始密码AUG位于 3～ 5残基 ,终止密码UGA位于 74 7～ 74 9残基。推测DpCPV多角体蛋白基因编码 2 4 8个氨基酸的多肽 ,分子量 2 8kD。和家蚕质型多角体病毒 (BmCPV)多角体蛋白基因相比较 ,核苷酸和编码氨基酸序列同源性分别为 89.3%和 97.6 %。

松毛虫质型多角体病毒林间增殖技术

系统介绍林间松毛虫质型多角体病毒增殖技术。内容包括增殖用病毒的提取方法，增殖林分的选择、增殖虫龄的确定，感染方法和感病虫的回收时间。

日本赤松毛虫质型多角体病毒Dendrolimus Spectabilis CPV对马尾松毛虫的生物测定

应用日本赤松毛虫质型多角体病毒(以下简称JDS-CPV)对马尾松毛虫第一代3龄和5龄幼虫进行了生物测定。结果表明,JDS-CPV对3龄和5龄幼虫的LC_(50)分别为1.6×10~5CPB/ml和3.3×10~5CPB/ml。其回归直线方程分别为Y=2.44+0.49x和Y=1.83+0.57x。对一代3龄虫的LD_(50)为2.1×10~3CPB/ml,回归直线方程为Y=1.72+0.98x。以1×10~8CPB/ml浓度为例的LT_(50),3龄虫为8.5天,5龄虫为13天。证实JDS-CPV对我国马尾松毛虫有较好的毒力。

落叶松毛虫的质型多角体病毒

在对落叶松毛虫进行综合治理研究时，从得病幼虫体内分离出一株质型多角体病毒（ＤｓＣＰＶ）。鉴于该病毒在国内未见报道，对其进行了形态、生物测定、组织病理及林间防治试验，结果质型多角体为０．１６μｍ×１．５７μｍ；病毒粒子为１６．０ｎｍ×５８．１ｎｍ；３龄和５龄落叶松毛虫幼虫的ＬＣ５０分别为２．８１×１０４ＰＩＢ／ｍＬ和７．１７×１０４ＰＩＢ／ｍＬ；该病毒感染幼虫中肠７２ｈ后形成多角体，１４４ｈ后形成大量的多角体。用１．１７×１０８ＰＩＢ／ｍＬ浓度的病毒悬液进行林间防治试验，其死亡率达８２％以上，平均达８４．６２％。

家蚕对马尾松毛虫质型多角体病毒的敏感性

用虫体克隆技术 ,对马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株 (DpCPV HN)进行了分离纯化 ,鉴定为质型多角体病毒 1型。以家蚕春蕾×镇珠杂种F1 代及自交的F2 代 4或 5日龄幼虫进行毒力测定 ,以纯化的家蚕质型多角体病毒对F1 代幼虫的毒力测定为对照。结果表明 :家蚕品种春蕾×镇珠对家蚕质型多角体病毒敏感 ,马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株能引起其感染发病 ;马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株感染家蚕品种春蕾×镇珠F1 代幼虫和F2 代幼虫 2 8天后的半致死剂量(LD50 )分别为 885个和 18个CPB (质多角体 ) ,前者为后者的 4 9倍。马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株感染后的家蚕 ,其结茧率、化蛹率、羽化率、全茧量、茧层量和单蛾产卵数均有所下降 ,全茧量、茧层量、茧层率和单蛾产卵数与病毒感染剂量之间无显著关联。

马尾松毛虫质型多角体病毒NS5蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

通过对马尾松毛虫质型多角体病毒的增殖、纯化.获得一株单一类型的质型多角体病毒。提纯的病毒粒子经SDS-热酚法抽提,在使用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离基因组dsRNA,回收纯化第九片段S9。SgRNA双链经高温变性.使用正反两种引物逆转录合成cDNA双链,使用同样的引物经PCR扩增后,克隆在pMDl8-T载体上。利用两种引物组合,获得了大小两个亚克隆片段。序列测定结果表明,较小亚克隆片段长405bp,较大亚克隆片段长677bp,经过序列拼接,得到一个977bp的序列,其中包含一个963bp大的开放阅读框(ORF)。推测DpCPVS9基因编码一个320个氨基酸的多肽,分子质量35.66kDa。和家蚕1型质型多角体病毒的I株(BmCPV-I1 strain)位于第几片段的。NS5蛋白基因相比较,核苷酸和编码氨基酸序列同源性分别为86.0％和93.4％。

替代宿主增殖松毛虫质型多角体病毒的比较研究

银纹夜蛾幼虫 (Argyrogrammaagnata)对松毛虫CPV(DpCPV)十分敏感 ,本文对两种不同的宿主增殖松毛虫CPV作了比较 ,电镜证实用替代宿主增殖的DpCPV与原毒株多角体 (CPB)和病毒粒子的形态完全一致。 3 %PAGE分析二者的RNA图谱基本一致 ,有大小相同的 2 .98× 10 6- 0 .6 6× 10 6道尔顿的 10条带 ,用它增殖的DpCPV(Aa DpCPV)对松毛虫有相当的毒力 ,每头 3龄幼虫病毒产量平均为 2 .5× 10 8CPB。

文山松毛虫质型多角体病毒(DpwCPV)NS5蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

通过对文山松毛虫质型多角体病毒 (DendrolimuspunctatusWenshanensiscytoplasmicpoly hedrosisvirus,DpwCPV)的增殖、纯化 ,获得一株单一类型的质型多角体病毒。提纯的病毒粒子经SDS 热酚法抽提得到基因组dSRNA ,使用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离并回收纯化第九片段S9。S9RNA双链经高温变性 ,逆转录合成cDNA双链。根据DpwCPV与BmCPV 1的同源性设计引物 ,将S9进行PCR扩增后 ,克隆到PMD1 8 T载体上。最终获得一个 977bp的序列 ,其中包含一个 963bp的开放阅读框 (ORF)。推测DpwCPVS9基因编码一个 32 0个氨基酸的蛋白 ,分子量约为 35 5 60。

马尾松毛虫质型多角体病毒S4的cDNA克隆及序列分析

从马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株中提取病毒核酸,回收、纯化第四片段S4,经RT-PCR扩增得到了S4的cDNA克隆并测定了其全序列。结果表明,S4全长由3262个碱基组成,包含一个编码1058个氨基酸的完整开放阅读框架。Blast同源分析显示,DpCPV s4与LdCPV S4、BmCPV S4和RRSV S2编码蛋白氨基酸的同源性分别为94％、92％和22％。另外,氨基酸序列部分区域与Methanosarcina mazei Goel的甲基化转移酶有同源性,且序列中含有鸟苷酸转移酶活性位点。

马尾松毛虫质型多角体病毒在昆虫细胞系中的离体增殖研究

本文报道了马尾松毛虫质型多角体病毒（简称ＤｐＣＰＶ）在５株昆虫细胞系，即棉铃虫卵巢细胞系ＳＦＥ－ＨＡ－８３１与ＳＦＥ－ＨＡ－８２１２、家蚕细胞系Ｂｍ－Ｎ、粉纹夜蛾细胞系ＴＮ－３６８和草地贪夜蛾细胞系Ｓｆ－２１中的增殖。证明ＤｐＣＰＶ可在ＳＦＥ－ＨＡ－８３１、ＳＦＥ－ＨＡ－８２１２、ＴＮ－３６８和Ｓｆ－２１４株细胞系中增殖。其中ＳＦＦ－ＨＡ－８３１细胞能同时复制几种型混合的ＤｐＣＰＶ；细胞的感染率在２０％－３５％左右，每个感染细胞约可产生５０－１００个多角体；感染细胞己传代２０次以上；离体和活体增殖的病毒的形态、感染力和核酸带谱等特征均保持稳定。

文山松毛虫质型多角体病毒杀虫剂的研制

报道了文山松毛虫质型多角体病毒杀虫剂的研制 ,包括多角体的纯化、辅助剂的筛选、剂型研制、产品包装以及病毒杀虫剂的产品质量检测及生产等。该杀虫剂为乳剂 ,多角体浓度达 2 .5×10 9PIB/mL ;所选辅助剂取材方便、容易配制 ,对环境没有污染。经安全检测证明 ,无致病菌 ,符合国家卫生标准 ,对试验动物小白鼠无毒性和致病性。生物测定用 1× 10 6PIB/mL感染 2龄文山松毛虫幼虫 ,其死亡率平均为 85 .5 %

影响棉铃虫增殖马尾松毛虫质型多角体病毒的条件因子的初步探讨

棉铃虫为马尾松毛虫多角体病毒 (DPCPV)理想的替代寄主。试验结果表明 ,不同接毒方法、接种浓度、接种温度及接种虫龄对棉铃虫增殖病毒有影响 ,以病毒涂在人工饲料表面的接毒方法、2 0～ 2 3℃温度及 3龄虫为最佳组合条件。由于利用棉铃虫生产出的病毒 (Ha DPCPV)容易诱发棉铃虫本身的多角体病毒 (NPV) ,尤其对那些带有NPV源的虫种 ,Ha DPCPV不宜作毒种 ,因此为慎重起见 ,最好用马尾松毛虫复制出的病毒作为生产毒种。