松脂醇二葡萄糖苷激活Wnt/β-catenin信号通路保护成骨细胞

背景:松脂醇二葡萄糖苷可以促进骨形成与骨基质的合成,加速骨组织修复,但其对成骨细胞的影响和作用机制仍需进一步探索。目的:基于Wnt/β-catenin信号通路探讨松脂醇二葡萄糖苷对地塞米松干预成骨细胞的影响和作用机制。方法:设置不同浓度的地塞米松组和松脂醇二葡萄糖苷组对成骨细胞干预24 h,筛选最佳干预浓度;使用地塞米松、松脂醇二葡萄糖苷和Wnt/β-catenin抑制剂XAV-939对成骨细胞进行干预,设置对照组、地塞米松组、抑制剂组、松脂醇二葡萄糖苷组、松脂醇二葡萄糖苷+抑制剂组。CCK-8法检测细胞活性,检测各组细胞碱性磷酸酶和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7酶活性,Annexin V/PI染色与EdU法检测细胞凋亡与增殖情况,Real-Time qPCR检测Wnt3a、β-catenin、c-myc、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白的mRNA表达水平,Western Blot检测Wnt3a、β-catenin、c-myc、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白的蛋白表达水平。结果与结论:①地塞米松和松脂醇二葡萄糖苷干预成骨细胞24 h后,发现浓度为10μmol/L的地塞米松细胞抑制率为实验最佳干预浓度;松脂醇二葡萄糖苷浓度在100μmol/L时,细胞增殖最为明显;②与地塞米松组比较,松脂醇二葡萄糖苷组的碱性磷酸酶活性显著增强(P<0.05),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7酶活性显著降低(P<0.05);Annexin V/PI染色和EdU法细胞增殖检测结果表明,松脂醇二葡萄糖苷可抑制地塞米松干预后成骨细胞的凋亡,促进成骨细胞增殖;③与地塞米松组和抑制剂组比较,松脂醇二葡萄糖苷组和松脂醇二葡萄糖苷+抑制剂组中Wnt3a、β-catenin、c-myc、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P<0.05);④结果表明,松脂醇二葡萄糖苷可以抑制地塞米松干预后的成骨细胞凋亡,通过激活Wnt/β-catenin信号通路来保护成骨细胞活性,促进成骨细胞增殖,可能发挥延缓激素性股骨头坏死的作用。

基于PI3K/Akt信号通路探讨松脂醇二葡萄糖苷对兔膝骨性关节炎软骨细胞保护机制的研究

目的探讨松脂醇二葡萄糖苷对兔膝骨性关节炎软骨细胞保护机制。方法制作兔OA模型,建模4周后,不同剂量的PDG干预5周;1周后取膝关节组织进行组织学分析(番红染色)并行Mankin评分;QRT-PCR/Western blot检测各组软骨组织中Aggrecan/collagen type II和MMP-1/MMP-3/MMP-13/TIMP-1的表达;ELISA/qRT-PCR检测各组兔血清中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的表达;TUNEL检测各组兔子软骨组织中软骨细胞凋亡情况;Western blot/免疫组化/qRT-PCR检测软骨组织中PI3K/Akt通路(PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt),以及Bcl-2,Bax等相关因子的表达。结果造模后3周后,模型兔出现关节强直样改变。PDG局部注射给药可缓解关节肿胀,缓解炎症反应。PDG给药可有效降低模型兔的炎症指标。PDG可能对膝骨性关节炎模型的软骨下骨形成有促进作用。PDG高剂量组的软骨破坏程度相对较轻,Akt信号通路在该模型中被激活。结论松脂醇二葡萄糖苷对兔膝骨性关节炎软骨细胞具有保护作用,PI3K/Akt信号介导了该保护机制。

基于Nrf2通路探讨松脂醇二葡萄糖苷改善小鼠骨质疏松的机制研究

目的分析松脂醇二葡萄糖苷(Pinoresinol diglucoside,PD)改善骨质疏松的作用机制。方法微型CT分析小鼠小梁骨体积/总体积(bone volume/total volume,BV/TV)、平均小梁厚度(average trabecular thickness,Tb.Th)、平均小梁数目(average number of trabeculae,Tb.N)和平均小梁间距(average trabecular spacing,Tb.Sp);HE染色检测骨组织损伤;TRAP染色分析成骨细胞数量/骨周长(number of bone cells/bone circumference,N.Ob/B.Pm)、空泡率以及破骨细胞表面/骨表面百分比(osteoclast surface/bone surface,Ocs/BS);ELISA检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrateresistant acid phosphatase,TRAP)相对活性,超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量;Wb检测核转录因子红细胞系2相关因子2(Nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2)和HO-1表达。结果与假手术组相比,模型组小鼠骨丢失量增加,BV/TV、Tb.Th、Tb.N、N.Ob/B.Pm、ALP相对活性、SOD、GSH、Nrf2和HO-1表达水平明显下降,Tb.Sp、空泡率、Ocs/BS、TRAP相对活性和MDA水平明显上升(P<0.05);E2组和PD组小鼠与模型组小鼠变化趋势完全相反(P<0.05),PD组和E2组小鼠上述指标无显著差异(P>0.05)。结论PD可通过激活Nrf2信号通路改善小鼠骨质疏松症状。

β-葡萄苷酶转化松脂醇二葡萄糖苷元的制备工艺

目的:利用β-葡萄糖苷酶催化水解杜仲主要降压活性成分松脂醇二葡萄糖苷(PDG),制备其苷元(PDG-A)。方法:对水解反应时间、p H及温度等条件进行优化,并采用液相质谱联用和核磁共振波谱等手段对产物进行结构解析。结果:β-葡萄糖苷酶水解PDG的最佳条件为:水解时间6h,水解p H5,水解温度50℃,三次实验的PDG-A收率分别为98.52%、97.91%、98.69%;PDG的水解产物为PDG(M=682)水解掉2个葡萄糖基团(M=162)而成的苷元结构(M=358),结合1HNMR及13C-NMR确定其为苷元PDG-A。结论:β-葡萄糖苷酶催化水解PDG制备其苷元PDG-A的反应温和、转化率98%以上,此方法可以为大规模制备PDG-A提供理论指导。

杜仲中松脂醇二葡萄糖苷的测定

目的探讨改进杜仲中松脂醇二葡萄糖苷测定方法。方法采用"石油醚除胶-甲醇提取"法提取杜仲特征性成分松脂醇二葡萄糖苷,色谱条件为Agilent TC-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为甲醇-水(25∶75),检测波长为277 nm,柱温为30℃。结果改进方法测得松脂醇二葡萄糖苷含有量高于药典法,松脂醇二葡萄糖苷在0.499 6～7.494μg范围内线性关系良好,平均加样回收率为98.03%,RSD为2.18%。结论该方法简单、准确、重复性好,可用于杜仲中松脂醇二葡萄糖苷的测定。

杜仲炮制前后松脂醇二葡萄糖苷含量的比较

目的以松脂醇二葡萄糖苷的含量为质控指标,筛选优化传统盐炙杜仲的炮制工艺,并与生杜仲进行比较。方法用正交设计法优选炮制工艺,采用RP-HPLC法测定松脂醇二葡萄糖苷的含量,作为杜仲质量控制的考察指标进行实验比较。结果杜仲的最佳炮制工艺:用盐量2.5%、温度135℃、时间30 min,杜仲生品中松脂醇二葡萄糖苷含量高于炮制品2倍以上。结论随着炮制品的温度升高和时间的延长,杜仲中松脂醇二葡萄糖苷含量逐渐下降。

杜仲叶中松脂醇二葡萄糖苷的提取分离及含量测定

采用溶剂法提取新鲜杜仲叶中的松脂醇二葡萄糖苷(PDG),以体积分数85%乙醇溶液为溶剂,杜仲叶与溶剂的比例为1:4(g/mL),60℃超声提取30min,真空抽滤得到滤液。用制备薄层分离纯化滤液,得到PDG提取产物,产率为2.00%。测定PDG标准物的紫外吸收光谱图,结果PDG在228nm处有最大吸收峰;用高效液相色谱法测定提取物样品中PDG的含量,检测波长228nm。PDG进样量在0.00238～0.0950mg/mL范围内呈良好的线性关系(y=84.8x+0.838,r=0.9993),平均回收率为102%。经测定,新鲜杜仲叶中PDG含量约为0.0960%,提取产物中PDG含量为4.54%。该方法操作简单,溶剂用量少,可有效提取并分离杜仲叶中的PDG。

茎点菌属产松脂醇二葡萄糖苷的培养条件优化

用响应面分析法对一株杜仲内生茎点霉(Phoma sp.)生产松脂醇二葡萄糖苷(PDG)的培养条件进行了优化,获得了PDG产量与各培养条件的回归模型,根据模型确定出PDG的最佳生产条件为:初始pH值8.4,摇床转速193r/min,装液量100mL,最佳条件下的PDG产量可达30mg/L。最佳条件下试验所得值与模型预测值间的偏差小于5%。

高效液相色谱法同时测定杜仲药材中绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷的含量

目的建立同时测定杜仲药材中绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷含量的高效液相色谱（HPLC）法。方法采用Diamonsil C18柱（5μm，250mm×4.6mm），以乙腈-水-0．4％磷酸水溶液（15：85：0．5）为流动相，检测波长227nm。结果样品中绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷的加样回收率分别为95％～98％，96％～103％；绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷的线性范围分别为0．298～2．98μg，r=0．9999和0．872～8、72μg，r=0．9998。结论贵州不同产地杜仲药材皮及叶中绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷的含量差异很大。

超高效液相色谱法测定青娥丸中松脂醇二葡萄糖苷的含量

建立了超高效液相色谱(UPLC)测定青娥丸中主要活性成分松脂醇二葡萄糖苷(pinoresinol diglucoside,PDG)含量的方法。样品经索氏提取后,提取物再用Waters Oasis HLB SPE固相萃取小柱进行前处理以消除杂质对PDG色谱峰的干扰。色谱条件:采用Waters Acquity C18BEH UPLC柱(100mm×1.0mm,1.7μm)分离,以乙腈-水(使用磷酸调pH值至4.0)(9∶91,v/v)为流动相,流速为0.1mL/min,检测波长为227nm,柱温为25℃,进样量为0.5μL。在上述条件下,松脂醇二葡萄糖苷在1.40～506.00mg/L范围内呈现良好的线性关系,相关系数r=1;低、中、高3个添加水平下的平均回收率分别为100.51%、102.37%、100.10%(n=9)。该方法准确、灵敏、重现性好,可用于青娥丸的质量控制。

杜仲总木脂素及松脂醇二葡萄糖苷的纯化研究

通过大孔吸附树脂-C18反相硅胶柱层析-正相硅胶柱层析联用技术,对杜仲总木脂素及松脂醇二葡萄糖苷(PDG)进行纯化研究。结果表明,含总木脂素23.33%和松脂醇二葡萄糖苷粗品0.960 5%的杜仲提取液经AB-8树脂一次纯化,可以制得71.61%的杜仲总木脂素有效部位以及8.070%的松脂醇二葡萄糖苷粗品,再经C18反相硅胶柱层析纯化,得到53.12%的松脂醇二葡萄糖苷。最后通过正相硅胶柱层析进一步纯化,得到91.50%的松脂醇二葡萄糖苷产品。

甘草、牡蛎、续断与杜仲配伍对京尼平苷酸、绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷煎出含量的影响

目的:建立杜仲水煎液中3种有效成分(京尼平苷酸、绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷)的含量测定方法,考察药对"杜仲-甘草"、"杜仲-牡蛎"、"杜仲-续断"不同比例配伍过程中有效成分含量的变化规律,为杜仲临床配伍应用提供研究基础。方法:制备不同配伍比例(1∶0.5,1∶1,1∶2)杜仲与甘草、牡蛎、续断的合煎液,以杜仲单煎液为对照,采用HPLC-DAD法检测杜仲各样品中3种有效成分的含量,统计分析不同配伍对杜仲3种有效成分煎出含量的影响。结果:杜仲单煎液中京尼平苷酸、绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷的煎出含量分别为0.649、0.069和0.440 mg/g。与杜仲对照组比较,杜仲-甘草配伍水煎液中京尼平苷酸和松脂醇二葡萄糖苷的煎出含量均随甘草比例的增加而升高,绿原酸的煎出含量随甘草比例的增加而降低;杜仲-牡蛎配伍水煎液中京尼平苷酸的煎出含量随牡蛎比例的增加而升高,绿原酸的煎出含量随牡蛎的占比增加而降低,而松脂醇二葡萄糖苷的煎出含量无显著性变化;杜仲-续断配伍水煎液中京尼平苷酸、绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷的煎出含量均随续断比例的增加显著升高。结论:药对"杜仲-甘草"、"杜仲-续断"配伍,对杜仲有效成分煎出含量影响较大,表明中医临床疗效与中药药对配伍剂量有密切关系。

杜仲茎点霉SP-16F产松脂醇二葡萄糖苷营养条件的优化

【目的】对杜仲茎点霉SP-16F发酵生产松脂醇二葡萄糖苷(PDG)的营养条件进行优化,以提高发酵液中的PDG产量。【方法】在单因素实验的基础上,通过三元二次中心组合设计和响应面分析法优化杜仲茎点霉SP-16F发酵产生PDG的最佳营养条件。【结果】在液体培养条件下,茎点霉SP-16F产PDG的最佳培养基组成为:蔗糖47.5 g/L,NaNO33.0 g/L,K2HPO42.83 g/L。在最佳培养条件下,PDG产量预测值较优化前的最大值提高了3倍以上。【结论】获得了茎点霉SP-16F的最佳产PDG培养基,有效地提高了其发酵产PDG的能力。

RP-HPLC法测定青娥丸提取物中松脂醇二葡萄糖苷含量(英文)

目的 建立测定青娥丸提取物中松脂醇二葡萄糖苷含量的RP HPLC法。方法 青娥丸提取物用 75 %乙醇提取 ,经AB 8大孔吸附树脂纯化后 ,注入高效液相色谱仪。本法采用ODS分析柱为固定相 ,以甲醇 乙腈 水 (2 4∶3∶78,V V V)为流动相 ,流速为 1 0mL·min- 1 ,紫外检测波长为 2 2 7nm。结果 松脂醇二葡萄糖苷的线性范围为 5 5 170 μg·mL- 1 (r>0 9998) ,平均回收率 99 3%。日内和日间精密度分别为 1 3%和 2 8% (n =5 )。青娥丸中松脂醇二葡萄糖苷的含量为 0 4 4 6± 0 0 12mg·g- 1 (n =10 )。结论 本方法灵敏、准确 ,专属性强 。

杜仲松脂醇二葡萄糖苷的提取工艺优化

首先采用二水平实验筛选出提取杜仲松脂醇二葡萄糖苷的主要影响因素:乙醇体积分数、浸泡时间和提取次数;再以提取物中松脂醇二葡萄糖苷含量为指标,通过正交实验优化提取工艺。确定最优提取工艺为:将粉碎的杜仲皮以料液比1∶12(g∶mL)加入75%乙醇后浸泡24h,超声提取2次,每次20min。在此条件下,提取物中松脂醇二葡萄糖苷的平均含量为1.51%。该优化提取工艺简单、快速、高效。

湘产杜仲中松脂醇二葡萄糖苷动态变化

目的 HPLC法测定湖南省桂东县杜仲GAP基地不同品种和不同采收期杜仲样品中松脂醇二葡萄糖苷的量.方法 杜仲三氯甲烷提取液分析采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm,5μm）,流动相为甲醇-水（25∶75）,检测波长为277 nm,体积流量为1.0 mL/min,柱温为25℃,进样量为5μL.结果 松脂醇二葡萄苷在0.49 ～4.90 μg范围内线性关系良好,r^2=0.999 9,其平均回收率为100.4％,RSD=2.1％.10年生以上的光皮杜仲和粗皮杜仲所含松脂醇二葡萄糖苷均高于0.10％,但前者高于后者.结论 推荐光皮杜仲为选优和繁殖的品种.

HPLC测定杜仲中松脂醇二葡萄糖苷的含量

目的 用高效液相色谱法测定杜仲中松脂醇二葡萄糖苷的含量。方法采用ODSC18柱（5μm，4．6mm×250mm），流动相为乙腈-0．1％磷酸（15：85），检测波长为227am，流速为1．0m；/min，柱温：30℃。结果松脂醇二葡萄糖苷在1．086～5．430μg范围内线性关系良好（r=0．9999），该方法的回收率为100．75％，RSD为2．03％（n=6）。结论该方法能够简便、快速、准确的测定杜仲中松脂醇二葡萄糖苷的含量。

杜仲中松脂醇二葡萄糖苷含量测定的样品处理方法优化

目的:建立一个快捷的杜仲中松脂醇二葡萄糖苷含量测定的样品处理方法。方法:以正交设计方法确定样品制备的最佳条件,采用HPLC法测定杜仲中松脂醇二葡萄糖苷的含量。结果:采用优化后的样品处理方法(药材粉碎过80目筛,控制超声频率60kHz,于45℃下提取20min)制备供试液,并用改良的色谱条件进行杜仲中松脂醇二葡萄糖苷的含量测定,所得结果与采用现行中国药典法(2005年版一部)测得的松脂醇二葡萄糖苷含量接近;含量测定中所采用的流动相为乙腈-水(15:85),获得了对称性良好的色谱峰和理想的分离度。结论:新建方法样品处理过程简便、迅速,含量测定结果准确可靠、分离效果好、稳定性好,可以快速并准确测定多批样品。

RP-HPLC法测定杜仲增免液中松脂醇二葡萄糖苷的含量

试验旨在建立测定杜仲增免液中松脂醇二葡萄糖苷含量的RP-HPLC法。以InersustainC18(250mm×4.6mm,5μm)为色谱柱,乙腈-0.2%磷酸(15∶85)为流动相,流速1.0mL/min,柱温35℃,紫外检测波长277nm。以乙酸乙酯作为提取溶剂,在所建立的色谱条件下测定供试品溶液,以理论塔板数和分离度作为系统适用性指标。对对照品松脂醇二葡萄糖苷溶液进行线性回归,确定线性范围,考察分析方法的精密度、稳定性、重现性,并进行加样回收试验。结果显示,用所建立的方法测定供试品溶液中松酯醇二葡萄糖苷理论塔板数为8 588,分离度为3.046。松脂醇二葡萄糖苷对照品溶液在6~192μg/mL浓度范围内线性关系良好,相关系数为0.9996;精密度试验结果显示松脂醇二葡萄糖苷对照品溶液峰面积相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为0.74%;重现性和稳定性试验结果显示供试品溶液中松酯醇二葡萄糖苷峰面积RSD分别为4.50%和2.69%;平均加样回收率为98.74%,RSD为0.65%(n=9);在所建立的色谱条件下,供试品中松脂醇二葡萄糖苷的平均含量为0.124~0.127mg/mL。结果表明,应用该方法测定杜仲增免液中松脂醇二葡萄糖苷的含量,系统适用性好,精密度高,重现性和稳定性好,回收率高,快速简便、准确可靠,可作为杜仲增免液中松脂醇二葡萄糖苷含量测定方法。

不同加工方法对杜仲中松脂醇二葡萄糖苷含量的影响

目的:考察不同加工方法对杜仲中松脂醇二葡萄糖苷含量的影响,为优化杜仲产地加工方法提供科学依据。方法:在产地将三批新鲜药材分别进行"直接晒干"、"发汗—晒干"、"微煮—发汗—晒干"、"微煮—切制—发汗—晒干"实验。并采用高效液相色谱测定不同加工方法杜仲中松脂醇二葡萄糖苷的含量变化。结果:不同加工方法样品松脂醇二葡萄糖苷含量的高低:"微煮—发汗—晒干">"发汗—晒干">"微煮—切制—发汗—晒干">"直接晒干"。结论:"发汗"在杜仲在产地加工中是必要的;微煮后再"发汗"的杜仲质量较佳。