松针褐斑病菌毒素LA-Ⅱ的分离纯化及其化学结构

松针褐斑病 (Lecanostictaacicola)是中国南方松树上的一种重要病害。松针褐斑病菌的代谢产物中含有可致松针萎蔫的有毒物质 ,经Rp 1 8柱反复分离松针褐斑病菌的次生代谢产物 ,获得有活性的黄色固体物质 ,采用丙酮结晶和重结晶纯化得到一无色针状晶体 ,生测有活性 ,记为LA Ⅱ。高效液相检测表明 :LA Ⅱ为一纯物质。采用质谱、红外光谱、核磁共振等波谱手段分析可知 :LA Ⅱ分子量为 1 1 8,其化学组成为C4H6O2 S ,分子结构为CH3COSCOCH3。

松针褐斑病菌的产毒培养和毒素粗提方法

松针褐斑病菌在PD和MS培养基中生长良好 ,能产生毒素。在这两种培养基中加入敏感寄主火炬松的针叶浸汁对毒素的产生和活性没有明显影响。甲醇、乙醇、正丁醇、氯仿甲醇 (氯仿∶甲醇 =2∶3)混合溶剂等均能把毒素物质充分提取出来 ,苯、氯仿、乙酸乙酯等极性小的溶剂不能充分提取毒素。通过生测和高效液相 (HPLC)比较分析表明 ,采用MS培养液培养病菌 ,以氯仿甲醇混合溶剂提取毒素 ,将有利于毒素的产生和毒素的分离。

松针褐斑病菌毒素的确定及其基本性质研究

以ＭＳ液体培养基培养２０ｄ左右至菌丝大量生长并紧密交织成团时病菌即可大量产生毒素，病菌是否产孢对产毒量大小无显著影响。毒素原液中仅非蛋白质部分具致病活性，经高温高压灭菌１５ｍｉｎ后活性仍不丧失，且有所加强。该毒素在冷冻条件或灭菌后于室温下可保存两个月以上而不失活。毒素粗提液中活性成分为一类极性较大的物质，易溶于水、甲醇、乙醇，可溶于正丁醇，微溶于乙酸乙酯，不溶于苯，可被活性炭吸附并为甲醇所洗脱。毒素粗提液的ｐＨ值为６０，渗透势为－１２２ｋＰａ，经试验确定毒素粗提液的毒性非溶液的酸度或渗透势所致，从而进一步确定了病菌人工培养滤液中存在具致病活性的毒素物质。

松针褐斑病菌毒素对寄主细胞质膜伤害机理的研究

用毒素粗提液处理寄主愈伤组织 2d后 ,可于光学显微镜下观察到严重的细胞原生质泡囊化现象 ,这是寄主受到毒素作用后于细胞水平所表现出的伤害症状。经毒素诱导后用ESR仪检测 ,寄主愈伤组织于 2h内即可产生比对照高得多的超氧阴离子自由基 ,继而诱发膜脂脂过氧化反应 ;随着毒素作用时间的延长 ,寄主细胞膜脂脂肪酸组成发生变化 ,总的变化趋势为不饱和脂肪酸含量减少 ,饱和脂肪酸含量增加 ;毒素作用后于 4h以内即可产生大量的MDA ,6h内则可检测到严重的离子渗漏 ,造成膜的破坏 。

松针褐斑病菌毒素LA-I的分离纯化及其化学结构

采用柱层析和高效液相色谱分离相结合 ,从松针褐斑病菌的PD培养液中分离提纯到一种致毒活性物质LA -I,该物质为无色油状物。紫外扫描显示LA -I的最大吸收波长为 2 0 7nm。在 36 5nm和 2 5 4nm波长下LA -I无吸收。FAB- MS和HRFAB- MS分别显示该毒素物质的相对分子质量和分子式为 16 2和C6 H1 0 O5;氢谱中的 2个信号 (δ1 2 6 ,δ4 2 2 )表明该毒素物质存在—OCH(CH3)—基团。碳谱显示有 3个碳信号 (δ181 0 9,δ6 6 99,δ2 1 6 9) ,证明存在—COOH ,—CH ,—CH3基团。综合质谱、核磁共振谱分析确定LA -I为COOHCH(CH3)OCH(CH3)COOH(α ,α′ -二丙酸醚 ) 。

松针褐斑病菌毒素对紫茎泽兰抗病相关酶的影响

采用紫茎泽兰Eupatoriumadenophorum叶片为材料,研究了松针褐斑病菌粗毒素处理后植物叶片6种抗病相关酶活性的变化。结果表明:浓度为1mg/mL粗毒素处理紫茎泽兰离体叶片后,紫茎泽兰抗病相关酶活性总体呈下降趋势。处理12h后,紫茎泽兰过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶分别比对照降低了80%,100%,53.8%,62%,61%,70%。

松针褐斑病菌毒素的层析分离及紫外吸收特性研究

以生测为导向,采用柱层析和薄层层析相结合,从松针褐斑病菌发酵液中分离出3个致毒活性组分m,p和q。经薄层层析检验可知m,q在A,C两个展开系统中Rf值一致,分别为0.57和0.75,且m,q展开后在254nm和365nm紫外光下都呈蓝色荧光,基本认为m和q是同一组分;p在365nm紫外光下为黄白色荧光,在A、C两个展开系统中Rf值分别为0.46和0.66。层析分离的结果表明,松针褐斑病菌可能含两个或两个以上的毒素物质。对m和p两组分进行紫外扫描的结果显示,m,p分别在波长210nm和208nm处有最大吸收峰,在365nm和254nm紫外光下无吸收或吸收很弱。高效液相分析显示:m,p都不是纯物质,在210nm检测波长下,m有3个吸收峰,保留时间分别为2.41,3.80和16.68min,p有4个吸收峰,保留时间分别为2.46,3.75,12.00和17.25min。研究结果表明组分m和p可能含有相同或相似的化学物质,要获得纯物质还需进一步分离。

松针褐斑病菌毒素活性的生物检测

松针褐斑病菌毒素不仅能伤害湿地松、火炬松等寄主植物的幼苗、针叶、根及愈伤组织 ,对非寄主植物水花生、紫茎泽兰的叶片也有伤害作用。在试验的几种生测材料中 ,湿地松愈伤组织对毒素伤害最敏感 ,湿地松幼苗、幼针叶 ,火炬松幼针叶和紫茎泽兰叶片次之 ,湿地松幼根、老针叶 ,火炬松老针叶 ,水花生和小麦叶片最不敏感。根据生测材料的敏感程度及表现症状的特异性分析可知 ,用湿地松、火炬松幼苗和幼针叶作生测材料较好。比较针刺法、浸渍法和涂抹法等几种生测方法表明 ,用针刺法接种毒素效果最好 ,其反应速度快 ,用量少 ,症状明显。因此建议在松针褐斑病菌毒素的生物检测中 ,以湿地松或火炬松幼苗或幼针叶作为材料 。

松针褐斑病菌毒素LA-Ⅰ和LA-Ⅱ致毒活性研究

研究比较了松针褐斑病菌 (Lecanostictaacicola)两个致病毒素LA Ⅰ和LA Ⅱ的热稳定性、寄主专化性和最低有效浓度以及它们间的相互关系。LA Ⅰ和LA Ⅱ均具热稳定性 ,经沸水水浴加热 15min仍具活性。LA Ⅰ和LA Ⅱ不仅能伤害易感寄主植物湿地松、火炬松 ,对云南松、华山松、紫茎泽兰等也有伤害作用 ,说明LA Ⅰ和LA Ⅱ均为非寄主专化性毒素。LA Ⅰ和LA Ⅱ配成不同浓度溶液生测 ,显示LA Ⅰ对湿地松幼苗的最低有效浓度为 10 0 μg·mL- 1 ,LA Ⅱ的最低有效浓度为 5 0 0 μg·mL- 1 ,LA Ⅰ活性较LA Ⅱ的活性高 4～ 5倍。LA Ⅰ和LA Ⅱ混合液生测表明 。

松针褐斑病菌毒素对紫茎泽兰伤害的初步研究

研究了松针褐斑病菌毒素对紫茎泽兰不同部位的伤害以及不同毒素粗提液浓度对叶片的伤害效果,进行了叶片愈伤组织的培养,在此基础上探讨了毒素对紫茎泽兰叶片和愈伤组织过氧化氢酶的影响.结果表明:紫茎泽兰叶片对该毒素最敏感,根对毒素只有轻微的反应;毒素粗提液稀释2倍,仍然对紫茎泽兰叶片有明显的伤害作用;以MS+6 mL(1 mg/mL)2,4-D培养紫茎泽兰叶片分化良好,愈伤组织生长速度快;毒素处理后叶片和愈伤组织CAT活性在6 h达到最高,呈现先升后降的趋势.

松针褐斑病菌和松针红斑病菌的风险分析

参照国内外有害生物风险分析(Pest Risk Analysis,简写PRA)方法,从有害生物的国内分布状况、潜在的危害性、寄主植物的经济重要性、传播扩散的可能性以及风险管理的难易程度等方面对松针褐斑病菌和松针红斑病菌的风险性进行定性和定量分析,评价结果表明:两者在我国均属于中度危险的森林有害生物,建议列入相关省区的检疫性林业有害生物补充名单进行管理。

松针褐斑病菌和4个球腔菌属真菌毒素杀草活性比较

以紫茎泽兰和湿地松幼苗为材料，研究球腔菌属4个菌种毒素粗提物活性，并与松针褐斑病菌对比。结果显示：褐孢霉菌和草莓蛇眼小球壳菌对湿地松幼苗和紫茎泽兰均具有伤害作用，且为非寄主专化性毒素。在MS液体培养基中，松针褐斑病菌产毒高峰为10～20d，20d达到最大；褐孢霉菌和草莓蛇眼小球壳菌产毒高峰为5～10d，10d左右达到最大。不同浓度毒素粗提液对紫茎泽兰伤害活性测定结果显示，松针褐斑病菌和褐孢霉菌毒素粗提物活性比草莓蛇眼小球壳菌毒素粗提物活性更强；梨球腔菌和柿子球腔菌在MS液体培养基中不能产生明显伤害生测材料的毒素物质。

松针褐斑病毒素的确定及其基本性质

以ＭＳ液体培养基培养２０ｄ左右至菌丝大量生长并紧密交织成团时病菌即可大量产毒，病菌是否产孢对产毒量大小无显著影响。毒素原液中仅非蛋白部分具致病活性，经高温高压灭菌１５ｍ ｉｎ 后活性仍不丧失，且有所加强。该毒素经冷冻或灭菌后于室温下可保存２个月以上而不失活。毒素粗提液中活性成分为一类极性较大的物质，易溶于水、甲醇、乙醇，可溶于正丁醇，微溶于乙酸乙酯，不溶于苯，可被活性炭吸附并为甲醇所洗脱。试验表明，毒素粗提液的ｐＨ值和渗透势分别为６．０和１．２２巴，毒素原液的毒性非ｐＨ值或渗透势所致，从而确定了病菌人工培养滤液中存在有具致病活性的毒素物质。