板蓝根多糖酶法脱蛋白工艺、组成分析与免疫调节活性研究

目的优化板蓝根多糖脱蛋白工艺,并进一步探讨其免疫调节活性,为板蓝根多糖的开发利用提供科学依据。方法通过单因素结合Box-Behnken响应面法优化酶法脱蛋白的最佳工艺条件;利用紫外可见光谱、傅里叶变换红外光谱、高效凝胶渗透色谱、高效液相色谱和扫描电镜等方法对板蓝根多糖化学组成与结构特征进行分析;采用斑马鱼免疫低下模型探讨脱蛋白板蓝根多糖对斑马鱼体内中性粒细胞、巨噬细胞、IL-1β和IL-6含量的影响。结果酶法脱蛋白最佳工艺为:胰蛋白酶500 U·mL^(-1)、pH 8.0、酶解时间5 h、酶解温度37℃,脱蛋白率为(86.39±0.07)%,综合评分(91.15±0.37)%。紫外、红外光谱扫描和电镜扫描显示酶法可以除去粗多糖中含有的蛋白质,脱蛋白后相对分子量在5.82~60.26 kDa之间,单糖摩尔组成为甘露糖∶鼠李糖∶半乳糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖=2.17∶0.96∶2.90∶83.25∶4.88∶5.84。免疫活性评价结果表明,脱蛋白后的板蓝根多糖浓度在50~300μg·mL^(-1)时,能显著增加斑马鱼免疫细胞密度,增加巨噬细胞增殖,降低免疫低下斑马鱼体内IL-1β和IL-6含量,从而发挥免疫调节作用。结论酶法可以有效去除板蓝根粗多糖中的蛋白质,脱蛋白后的板蓝根多糖具有一定的免疫调节作用。

板蓝根多糖对鸡新城疫疫苗免疫效果的影响

150只14日龄蛋公鸡随机均分成3组,用新城疫传染性支气管炎二联(Newcastle disease-infectious bronchi-tis,ND-IB)弱毒苗点眼滴鼻免疫的同时,2个试验组分别肌肉注射高、低剂量的板蓝根多糖(Isatis root polysaccha-ride,IRPS)溶液,对照组注射生理盐水,每天注射1次,连续注射3次。分别于免疫后7、14、21、28、354、2 d各组随机抽取8只鸡翼下静脉采血,分离血清,用微量法测定新城疫血凝抑制(HI)抗体效价;于免疫后10、20、30、40、50 d每组随机抽取5只鸡心脏采血,分离淋巴细胞,用流式细胞仪双染色法检测CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞含量,并放血致死称取体质量和胸腺、脾脏、法氏囊的质量,计算器官指数。结果表明,板蓝根多糖高、低剂量组的HI抗体效价、CD4+/CD8+比值和免疫器官指数均明显高于对照组;提示板蓝根多糖对新城疫疫苗的免疫效果有明显的增强作用。

板蓝根多糖对猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫猪T细胞亚群的影响

目的:研究板蓝根多糖对猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫猪T细胞亚群及抗体的影响。方法:以板蓝根多糖作为免疫增强剂联合猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫仔猪,通过流式细胞仪检测猪外周血CD3+、CD4+、CD8+细胞百分数,并用ELISA法检测猪血清中抗猪繁殖障碍与呼吸道综合征病毒抗体水平。结果:板蓝根多糖能显著提高仔猪的CD3+、CD8+淋巴细胞的百分数和特异性抗体滴度。结论:板蓝根多糖能显著增强猪对常规灭活病毒疫苗的免疫应答能力。

板蓝根多糖的提取和纯化工艺研究

目的研究板蓝根水溶性多糖的提取纯化工艺条件。方法通过正交实验,考察液料比、提取时间、提取温度、醇沉时间、醇液比对多糖得率的影响。结果液料比是影响提取工艺的主要因素,最佳工艺条件为:液料比30∶1,提取温度90℃,提取时间6 h。三氯乙酸法脱蛋白,葡聚糖凝胶柱层析纯化分离。结论板蓝根多糖得率25.63%,多糖含量76.42%。纯化后的板蓝根多糖为分子大小均一的单一组分多糖,不含核酸和蛋白质。

板蓝根多糖对体外培养的猪脾脏淋巴细胞增殖及分泌细胞因子和NO的影响

用MTS比色法测定了不同质量浓度的板蓝根多糖对体外培养的猪脾脏淋巴细胞增殖的影响,分别用ELISA法和硝酸还原酶法测定了板蓝根多糖对猪脾脏淋巴细胞分泌IL-2,IL-4,IFN-γ和NO的影响.结果表明,板蓝根多糖能显著促进猪脾脏淋巴细胞的增殖,同时又能协同ConA或LPS诱导的猪脾脏淋巴细胞增殖(P<0.05);能显著促进由ConA诱导的猪脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ,抑制IL-2的分泌,对IL-4分泌的影响不明显;低剂量板蓝根多糖能显著促进NO的分泌(P<0.01).

板蓝根多糖对PRRSV的体外抗病毒试验

水煮醇沉法从中药板蓝根中提取板蓝根多糖,以其为试验药物,观察在Marc-145单层细胞上对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的作用效果。结果表明,在安全浓度范围内,板蓝根多糖体外对PRRSV具有较好的阻断和抑制作用,其最小阻断浓度为2.094μg/mL,最小抑制浓度为8.375μg/mL。

黄芪和板蓝根多糖的抗菌抗病毒作用研究

将黄芪和板蓝根多糖开发成绿色抗菌抗病毒添加剂。先进行体外抗菌试验比较黄芪多糖、板蓝根多糖对大肠杆菌或沙门氏菌作用;然后通过鸡胚法和鸡群攻毒保护法测定黄芪多糖、板蓝根多糖对新城疫病毒的作用;再通过饲养试验研究黄芪多糖、板蓝根多糖对鸡生长性能和免疫系统的影响。板蓝根多糖的抑菌能力较弱,而黄芪多糖则没有抑菌能力;两种多糖(药物浓度1 mg/ml)与病毒直接混合后均有明显的抑制病毒增殖的作用;与基础对照组相比,黄芪多糖能显著促进鸡体内T细胞的转化(P<0.01),而板蓝根多糖对T细胞转化影响差异显著(P<0.05)。黄芪多糖使鸡的脾脏指数极显著升高(P<0.01)、法氏囊指数、鸡胸腺指数显著升高(P<0.05),对肥大细胞数影响差异不显著(P>0.05),而板蓝根多糖对脾脏指数无显著影响(P>0.05)、使法氏囊指数极显著降低(P<0.01)、极显著提高鸡胸腺指数和肥大细胞数目(P<0.01)。黄芪多糖、板蓝根多糖均使试验组鸡的日增重有一定的提高,但差异不显著(P>0.05)。黄芪和板蓝根多糖可以开发成一种抗病毒饲料添加剂和免疫保护制剂。

板蓝根多糖的提取及其对猪繁殖与呼吸综合征病毒的体外作用

用水煮醇沉法从中药板蓝根中提取板蓝根多糖,作为试验药物,观察其在Marc-145单层细胞上对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的作用效果。结果表明,在安全浓度范围内,板蓝根多糖体外对PRRSV具有较好的阻断和抑制作用,最小阻断浓度为2.094μg/ml,最小抑制浓度为8.375μg/ml。

板蓝根多糖对无初乳仔鼠十二指肠IgG^+和SIgA^+细胞表达的影响

目的研究不同浓度板蓝根多糖(Indigowoad Root Polysaccharide,IRP)对SD系无初乳仔鼠十二指肠IgG+和SIgA+细胞表达的影响。方法 40窝0 d仔鼠随机分为A～E组:(A)初乳组,(B)常乳组,(C)常乳+高IRP组,(D)常乳+中IRP组,(E)常乳+低IRP组。各组分别灌胃生理盐水,生理盐水,低、中、高剂量的IRP,于0、7、14、21、28 d随机取6只进行取材,运用免疫组织化学技术,通过Moticam 2306图像处理系统对各实验组仔鼠十二指肠中IgG+和SIgA+细胞及分泌物的分布和面积进行统计分析。结果 IgG+和SIgA+细胞首先出现于腺体周围固有层,然后在绒毛固有层、上皮细胞之间和肌层也有分布。IgG+和SIgA+细胞数量随日龄增大而增加,且C、D、E组的IgG+和SIgA+细胞数量在7～28 d高于B组。在7～14 d、14～21 d、21～28 d发挥最佳效果的组别依次为E、D、C组。结论 IRP可以促进无初乳仔鼠十二指肠黏膜IgG+和SIgA+细胞的表达。随着日龄增大,发挥最佳免疫效应的IRP浓度逐渐减小。

板蓝根多糖对小鼠的免疫调节作用

腹腔注射板蓝根多糖可明显增强小鼠对DNCB的迟发型变态反应,诱导体内淋巴细胞转化和增强脾细胞的NK活性。

板蓝根多糖对小鼠抗流感病毒感染的作用

目的研究板蓝根多糖对小鼠抗流感病毒感染能力的影响。方法将板蓝根多糖溶液腹腔注入流感病毒感染的模型小鼠,观察小鼠的生存时间,计算肺指数,测定小鼠血清中抗病毒IgG的变化及脾细胞IFN-γ的水平。结果注射板蓝根多糖的小鼠存活时间延长、存活率提高。与病毒对照组比较,肺指数明显降低,血清中抗体IgG的水平升高,脾脏细胞IFN-γ的水平上升。结论板蓝根多糖能促进小鼠非特异性免疫、增强体液的免疫功能,并参与了调节细胞的免疫功能,从而提高了小鼠抵抗流感病毒感染的能力。

板蓝根多糖胶冻的研制及其品质评价

研制板蓝根多糖胶冻,并对其品质进行评价。以模拟板蓝根制药残渣为原料,用水浸提板蓝根多糖,制备板蓝根多糖胶冻,浸提温度95℃,在特定料液比下浸提3次,每次浸提时间2h,提取的多糖液经过滤、离心后加入适量的卡拉胶溶液,再辅以果汁粉、绵白糖、柠檬酸、香精、色素等制成溶胶,室温胶凝后制得板蓝根多糖胶冻。结果表明,在板蓝根多糖提取液(18.9mg/mL)与卡拉胶溶液(20mg/mL)体积比3:7、绵白糖加量30mg/mL、果汁粉加量45mg/mL、柠檬酸加量0.6mg/mL时口感最佳(色素和香精的加入视需要而定),板蓝根多糖胶冻冻体均匀、色美味佳,其内聚性、黏附性、胶黏性、咀嚼性、弹性和硬度等力学性质能很好地满足食用需要。加入2.0mg/mL山梨酸钾并经高压蒸汽灭菌后,保质期可达5个月以上。利用板蓝根制药残渣提取多糖、制备胶冻是开发多糖保健食品的较好途径。

板蓝根多糖对NF-κB活性的作用

观察板蓝根多糖对核因子 κB(nuclearfactorKappaB ,NF κB)核结合活性的影响。以内毒素 (LPS)刺激J744 .a .1小鼠的巨噬细胞株 ,可诱生出较高的NF κB与DNA结合活性 ,分别采用LPS预刺激、LPS后刺激和LPS与板蓝根多糖同时刺激等 3种方法对其处理 ,分离核蛋白 ,进行NF κB与DNA结合活性测定 ,结果用光密度扫描定量分析。板蓝根多糖在 3种情况下均可降低LPS刺激所致的NF

板蓝根多糖促进NKG2D配体表达增强NK细胞对食管癌细胞的杀伤作用及机制研究

目的:研究板蓝根多糖(RIP)影响NK细胞对食管癌细胞杀伤作用的分子机制。方法:MTT法检测细胞增殖率,Western blot检测增殖相关蛋白CyclinD1、p21和p27的表达,ELISA法检测培养上清中IFN-γ和TNF-α的表达,流式细胞术检测NKG2D配体MICA、MICB、ULBP1和ULBP2的表达,钙黄绿素释放法(CARE-LASS)检测NK细胞对食管癌细胞的杀伤率。结果:RIP可促进NK-92细胞增殖,抑制食管癌Eca-109细胞增殖,且具有显著剂量依赖性。食管癌可促进NK细胞中TNF-α和IFN-γ的表达。RIP可促进食管癌细胞Eca-109中NKG2D配体MICA、MICB、ULBP1和ULBP2的表达,促进与食管癌细胞联合作用后NK细胞中TNF-α和IFN-γ表达,提高NK-92细胞对食管癌Eca-109细胞的杀伤活性。结论:RIP通过提高食管癌Eca-109细胞中NKG2D配体表达,促进NK-92细胞中TNF-α和IFN-γ表达,增强NK-92细胞对食管癌细胞的杀伤作用。

板蓝根多糖抑制致病性大肠埃希菌细胞黏附的试验研究

研究板蓝根多糖能否影响致病性大肠埃希菌对细胞的黏附。使用PK-15细胞进行了黏附试验及黏附抑制试验。在所选的4个浓度中,板蓝根多糖浓度为1.6mg/mL时,对细菌黏附细胞的抑制作用最好,黏附力由每个细胞黏附44.8个细菌降低到6.3个细菌。板蓝根多糖对致病性大肠埃希菌的细胞黏附具有抑制作用,提示该多糖具有调节肠道微生态的潜在应用价值。

板蓝根多糖抗小鹅瘟病毒的作用

在鹅胚内用板蓝根多糖(IRPS)作直接杀毒和阻断感染试验,对鹅胚尿囊液中小鹅瘟病毒(GPV)含量、鹅胚存活时间、存活率、病变和免疫组化进行测定。结果显示,40μg/胚IRPS阻断感染组,GPV接种后72h ELISA检测为阳性的尿囊液最高稀释倍数23;鹅胚平均存活时间192h;存活率6/6;胚体肉眼观察未见病变;切片镜检可见肝、肾轻度淤血和细胞变性,心、脑轻度淤血和水肿;免疫组化显示肝、肾内GPV表达抗原为弱阳性,心、脑内为阴性。而攻毒对照组尿囊液GPV阳性的最高稀释倍数28;鹅胚存活时间138h;存活率0/6;胚体严重萎缩、出血、水肿,各组织细胞碎裂、坏死,组织内GPV表达抗原全为强阳性。两者比较,各指标具有极显著差异。这表明在鹅胚内IR-PS具有极强的阻断GPV感染、增殖和保护胚体组织器官免受其损伤的作用。

板蓝根多糖的提取及其对猪细小病毒的体外作用

用水煮醇沉法提取板蓝根多糖,通过观察PK-15细胞病变效应(CPE)来评价板蓝根多糖的不同加药方式体外对猪细小病毒(PPV)的阻断和抑制作用。结果表明板蓝根多糖在对细胞的安全浓度范围内,对猪细小病毒有明显的阻断作用和抑制的作用,最小的阻断浓度为2.09μg/ml,最小的抑制浓度为4.19μg/ml。

板蓝根多糖对PRRS弱毒苗免疫猪抗体和T细胞亚群的影响

研究板蓝根多糖对PRRSV弱毒苗免疫抗体和猪外周血T细胞亚群的影响。35日龄断奶仔猪16只随机分为4组,将多糖分别以高、低两个剂量和猪PRRSV弱毒苗同时注射,于免疫后不同的时间点采血,ELISA方法检测猪PRRSV抗体水平,流式细胞术检测猪外周血中T淋巴细胞亚群的变化。弱毒苗免疫后7d,板蓝根多糖高剂量组即可检测到PRRSV阳性抗体,而其它组在免疫后14d,均可检测到PRRS阳性抗体,板蓝根多糖对PRRS弱毒苗产生抗体的影响是和剂量密切相关的,高剂量能提高抗体水平,低剂量会阻碍PRRSV抗体的产生。板蓝根多糖和PRRS弱毒苗联合使用对猪外周血CD3+和CD4+细胞数量的影响不显著,在早期可促进猪外周血CD8+细胞的增殖。合适剂量的板蓝根多糖可以作为免疫增强剂与PRRSV弱毒苗联合使用。

板蓝根多糖通过TLR4-NF-κB通路对结核大鼠肺部炎症影响的机制研究

目的:探究板蓝根多糖通过Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)-核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)通路对结核大鼠肺部炎症的影响机制。方法:45只SD大鼠随机分为3组(n=15):对照组、模型组、板蓝根多糖组。通过尾静脉注射H37RV结核分枝杆菌建模,在感染的第2天板蓝根多糖组大鼠接受板蓝根多糖灌胃干预。检测和比较各组小鼠血清炎性因子以及肺组织TLR4-NF-κB通路和炎性因子表达水平。结果:模型组肺组织中感染大量的结核分枝杆菌,并且成团聚集在细胞外,板蓝根多糖组的CFU水平显著低于模型组(P<0.05),结核分歧杆菌数量少于模型组(P<0.05),主要分布于结核结节和巨细胞中。模型组血清炎性因子水平显著高于对照组,板蓝根多糖组血清中白细胞介素质1β(IL-1β)、白细胞介素质6(IL-6)、干扰素-γ(IFN-γ)水平显著低于模型组而显著高于对照组(P<0.05)。模型组肺组织中TLR4-NF-κB通路及炎性因子mRNA水平显著高于对照组,板蓝根多糖组肺组织中TLR4、NF-κB、IL-1β、IL-6、IFN-γ水平显著低于模型组而显著高于对照组(P<0.05)。模型组肺组织中TLR4-NF-κB通路表达水平显著上调,板蓝根多糖组肺组织中TLR4、NF-κB蛋白水平显著低于模型组而显著高于对照组(P<0.05)。结论:板蓝根多糖可以通过调节TLR4-NF-κB通路减轻结核分歧杆菌感染引起的肺部炎症反应。

板蓝根多糖对内毒素诱导人单核/巨噬细胞炎症因子表达的影响

目的研究板蓝根多糖(IIP)对内毒素诱导的人单核/巨噬细胞中多种炎症因子表达的影响。方法采用体外培养的人单核/巨噬细胞分为空白对照组(Control组)、内毒素(LPS)组、板蓝根多糖+LPS组(IIP+LPS组),以100ng/ml内毒素作为刺激因子,分别加以相应的干预。应用人炎症因子抗体芯片检测各组人单核/巨噬细胞中IL-1β、IL-6、IL-8和金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)等炎症因子表达的变化情况。结果与Control组比较,LPS组中IL-1β、IL-6、IL-8的表达增强,而IIP+LPS组中IL-1β、IL-8、TIMP-2的表达增强。与LPS组比较,IIP+LPS组的IL-1β、IL-6的表达降低,TIMP-2蛋白升高,差异有统计学意义(P<0.01)。结论板蓝根多糖对内毒素诱导的人单核/巨噬细胞多种炎症因子表达有调节作用。