极端耐热木聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合表达

目的:为了在枯草芽孢杆菌中整合表达极端耐热木聚糖酶。方法:将嗜热网球菌(Dictyoglomus thermophilum)Rt46B.1的极端耐热木聚糖酶基因xynB通过穿梭载体pDL整合到B.subtilis168染色体上,使其实现表达。结果:极端耐热木聚糖基因在枯草芽孢杆菌中成功整合并表达。结论:基因工程菌B.subtilis168-xynB能外泌表达极端耐热木聚糖酶,且表达水平为0.732IU/mL,比在大肠杆菌中的高。酶学性质表明,此酶分子量约为24kD,其最适反应温度为85℃,最适反应pH值为6.5,且在弱碱性条件下稳定。

极端耐热木聚糖酶基因在大肠杆菌中的高效表达

海栖热袍菌Thermotogamaritima为嗜极端高温的厌氧细菌 ,其产生的极耐热性木聚糖酶B具有非常可观的工业应用前景。但编码该酶的基因xynB在大肠杆菌中的表达较困难。文中利用PCR技术将xynB克隆至原核表达载体pET 2 0b ,并与组氨酸标签进行融合构建成重组质粒 pET 2 0 xynB。研究发现 ,pET 2 0 xynB在稀有密码子AGA ,AGG和AUA得到加强的大肠杆菌宿主菌株BL2 1 CodonPlus(DE3 ) RIL中 ,木聚糖酶基因的表达水平远远高于在其他菌株中的表达。结合对重组菌的诱导条件的优化 ,使得重组蛋白表达量达到11 5 % ,比酶活达到 2 5 69U/mg ,比常规基因工程菌株提高 12 5倍。

耐热木聚糖酶研究进展

木聚糖是自然界中含量第二丰富的多糖,是一种可再生资源,木聚糖酶能够降解木聚糖,被广泛应用于化工、食品、饲料、造纸、废物处理和制药等工业领域。大多数天然木聚糖酶热稳定性较差,利用基因工程和蛋白质工程手段对木聚糖酶进行改造,使木聚糖酶热稳定性提高,对工业生产有着重要的现实意义。在分析耐热木聚糖酶结构特点的基础上,对提高木聚糖酶热稳定性的技术手段的研究进展进行了综述,包括固定化、定向进化、半理性设计、理性设计、构建嵌合体,为拓宽耐热木聚糖酶的应用范围提供了帮助。

重组大肠杆菌生产极端耐热木聚糖酶

将含有来自于嗜热网球菌(Dictyoglomusthermophilum)Rt46B.1编码极端耐热木聚糖酶基因xynB的表达载体pET?DBc转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3),获得重组菌E.coliDB1,目的基因可表达出有活性且耐90oC的木聚糖酶.初步优化的E.coliDB1发酵培养基的组成为(g/L):葡萄糖50,NH4Cl3,MgSO40.5,CaCl20.6,Na2HPO4?7H2O12.8,KH2PO43.0,NaCl0.5.重组菌E.coliDB1木聚糖酶的耐热特性有利于木聚糖酶的下游回收和提取.

生物质降解菌系中GH11家族耐热木聚糖酶基因的克隆与鉴定

以玉米芯粉为基质富集培养牛粪中生物质降解菌系,提取该降解菌系的宏基因组DNA,并以其为模板,通过简并引物PCR扩增出200bp左右的木聚糖酶基因片段,选择与耐热木聚糖酶相似性最高且丰度最高的基因序列,应用mTAIL-PCR扩增得到1 059bp的基因全长序列(xynHAD4),编码352个氨基酸,经序列比对分析,该木聚糖酶(XynHAD4)属于典型的GH11家族木聚糖酶,与来源于Dictyoglomus thermophilum的xylanase229B相似度为93%。将xynHAD4连接于表达载体pET22b(+),在E.coli BL21中成功得到表达,表达产物经纯化后,测定其分子质量约为36kDa,最适作用温度和pH分别为80℃和6.0,该酶在90℃保温1h,残余酶活为72%,pH作用范围较广,在pH4.0保存1h,残余酶活为82%,可见,XynHAD4属于耐热木聚糖酶,并且在酸性条件下可保持较高稳定性,在食品、饲料等领域具有潜在的应用价值。

大肠杆菌重组菌生产极端耐热木聚糖酶的研究

将含有来自于嗜热网球菌 (Dictyoglomusthermophilum)Rt4 6B .1编码极端耐热木聚糖酶基因xynB的表达载体pET -DBc转化大肠杆菌EscherichiacoliBL2 1(DE3) ,获得重组菌E .coliDB1,目的基因可表达出有活性且耐 90℃的木聚糖酶。E .coliDB1发酵培养基的较佳组成为 (g/l) :葡萄糖 5 0 ,NH4Cl 3、MgSO40 .5、CaCl2 0 .6、Na2 HPO4·7H2 O 12 .8、KH2 PO43.0和NaCl 0 .5。在工程菌培养的对数生长前期加入终浓度为 1mmol/l的异丙基硫代 - β -D -半乳糖苷 (IPTG)进行诱导 ,对菌体生长无阻碍作用 ,木聚糖酶酶活在菌体生长的后期达到最高 ,利用优化的培养基在不加入IPTG的情况下木聚糖酶酶活仍维持在很高的水平。

枯草芽孢杆菌分泌表达极耐热木聚糖酶及其酶学性质

为将海栖热袍菌极耐热木聚糖酶基因xyn B（Gen Bank登录号AY340789）在枯草芽孢杆菌Bs916中进行异源分泌表达,并阐明工程菌分泌重组木聚糖酶的酶学性质。克隆极耐热木聚糖酶基因xynB,将其与罗克霉素启动子融合,构建融合质粒载体pXYNB2,将其转化到枯草芽孢杆菌Bs916中,获得重组枯草芽孢杆菌（Bs916/p XYNB2）,并对重组芽孢杆菌分泌表达的极耐热木聚糖酶的酶学性质进行了研究。SDS-PAGE法测定重组枯草芽孢杆菌分泌的蛋白在相对分子质量43 000处有明显的蛋白表达条带。重组木聚糖酶的最适反应p H值为5.0-5.8,重组木聚糖酶的最适反应温度大于或等于100℃,重组极耐热木聚糖酶在pH值4.6-7.8比较稳定,重组木聚糖酶的温度稳定性在90℃下保温2 h后残存酶活83%。可见,生防枯草芽孢杆菌Bs916能有效分泌表达极耐热木聚糖酶,为以后构建多种纤维素和半纤维素在其中的协同表达,拓宽其碳源利用范围奠定基础。

耐热木聚糖酶的性质及应用

木聚糖酶(EC3.2.1.8)可催化木聚糖的水解,可应用于食品、酿酒、造纸、饲料、纺织等行业。由于许多工业应用的单元操作都是在高温下进行的,寻求耐热木聚糖酶是非常重要的。该文介绍了耐热木聚糖酶菌的筛选、基因工程和分离纯化的研究及应用。

嗜热裂孢菌木聚糖酶在毕赤酵母中的表达及酶学性质

将优化后的来自嗜热裂孢菌的木聚糖酶基因在毕赤酵母中进行异源表达并分析了其表达产物的酶学性质。对来源于嗜热裂孢菌的木聚糖酶基因催化域进行密码子优化,人工合成优化后的木聚糖酶成熟肽基因xyl11~M,构建重组表达质粒pPIC9K-xyl11~M,将其经SalⅠ线性化后电击转化毕赤酵母GS115,经G418筛选得到重组工程菌GS115/xyl11~M,甲醇诱导表达重组蛋白。表达的重组蛋白reXyl11M经SDS-PAGE分析,其相对分子质量约34 000,酶活性可达到105.3 U/m L,最适反应温度为70℃,并在30~75℃温度内较稳定;最适反应pH为6.0,在pH6.5~7.5范围内稳定;Co^(2+)、Ba^(2+)、Cu^(2+)、Li^+对酶活性有强烈的激活作用,Fe^(3+)有明显的抑制作用,其它金属离子及EDTA对re Xyl11M酶活性影响不大。结果表明xyl11M成功在毕赤酵母GS115中实现表达,且reXyl11~M的酶学特性优良。

重组枯草芽孢杆菌产极端耐热木聚糖酶条件的优化

对基因工程菌Bacillus subtilis-xyB在摇瓶发酵水平产极端耐热木聚糖酶条件进行了优化。结果表明:该基因工程菌发酵产极端耐热木聚糖酶的优化后的培养基配方是:4%麸皮、1%(NH4)2HPO4、0.1%K2HPO4、0.2%吐温80、1mmol/LFe2+,初始pH为自然值(7.0)。优化后的摇瓶发酵条件是:36℃、转速180r/min、500mL三角瓶中加入50mL培养基、接种量2%。采用优化后的培养基发酵培养18h酶活力达到最大值10.71XU/mL。与优化前相比,产酶最高峰提前6h,而木聚糖酶活力是优化前的2.5倍,本实验得到的优化发酵条件大大提高了重组菌产酶能力。

产木聚糖酶嗜热真菌鉴定、酶基因克隆及生物信息学分析

木聚糖酶是一类木聚糖降解酶系,在食品、饲料领域应用广泛。本实验对实验室前期保存的一株产木聚糖酶真菌TL01进行形态学、18S rDNA及产酶鉴定,其结果表明TL01为梳棉状嗜热真菌(Thermomyces lanuginosus),以木糖为底物,测得粗酶液酶活为0.250±0.03 U/m L。对其两种主要的木聚糖酶基因(xyn11A和xyl43)进行克隆并对其编码蛋白(Xyn11A和Xyl43)进行了生物信息学分析。Xyn11A预测蛋白分子量24.36 kD,等电点为4.77,含有19个氨基酸的信号肽序列,属于亲水性蛋白,无跨膜结构域,其二级结构主要是无规则卷曲(44.89%);Xyl43蛋白分子量38.24 kD,等电点为5.23,编码的胞内蛋白属于亲水性蛋白,无跨膜结构域,无规则卷曲(59.76%)是其主要的二级结构。本研究通过对Th. lanuginosus TL01的xyn11A和xyl43基因克隆及其编码蛋白的生物信息学分析,为后续进一步构建高效表达工程菌株奠定了基础。

国家发改委公布微生物高技术产业化专项

按照国家发展改革委组织申报微生物制造高技术产业化专项要求．经对申报项目审理．日前公布了高技术产业化专项：河南巨龙淀粉公司谷氨酸棒杆菌突变株发酵法生产L-色氨酸：河南仰韶生化公司耐热木聚糖酶高技术产业化示范工程承德避暑山庄集团公司年产1万t木聚糖酶：吉林市科大公司年产15000t基因重组纤维素酶：无锡晶海氨基酸公司年产1500t支链氨基酸发酵：山东省齐河百多安生物医药公司基因工程微生物谷氨酰胺转氨酶（MTG）；