长枝木霉代谢物对极细链格孢产毒抑制机制解析

【目的】明确长枝木霉(SC5)代谢粗提物对极细链格孢(ABL2)产毒抑制机制。【方法】以富士苹果的叶片为供试材料,通过生长速率法、LC-MS和RT-qPCR技术测定了SC5代谢粗提物对ABL2菌落生长、6种非寄主选择性毒素产生及产毒相关基因表达的抑制作用。【结果】质量浓度为0.5 mg·mL^(-1)的SC5代谢粗提物对ABL2菌落生长和致病力具有显著的抑制作用,第6天时抑制率分别为38.08%和76.96%;同时,0.5 mg·mL^(-1) SC5代谢粗提物对ABL2菌株产生的非寄主选择性毒素TEN、ALT和TeA均具有显著抑制作用,其中处理2d后对毒素的抑制作用最显著,其含量分别降低69.39%、98.51%和48.99%,并且其合成相关基因TES、TES(1)、PksA和PksJ的表达量显著下调,分别降低89.02%、98.20%、46.49%和40.13%,但是对ABL2菌株非寄主选择性毒素ATX-I含量和参与编码其合成的PksF基因表达量具有提升作用。【结论】质量浓度为0.5mg·mL^(-1)的SC5代谢粗提物对ABL2菌株生长和致病力具有抑制作用,可能通过调控ABL2菌株TES、TES(1)、PksA和PksJ基因下调表达,进而降低TEN、ALT和TeA的毒素的产生量及致病力。

一种促进植物根系生长的极细链格孢菌蛋白质分离、纯化和生物功能

通过硫酸铵沉淀、有机溶剂沉淀、离子交换和分子筛连用的方法,从极细链格孢菌JH505菌株中分离纯化到分子量约为35kD的植物激发子。利用固相梯度凝胶双向电泳方法测定了该蛋白的等电点为4.22。将该纯化蛋白稀释液浸泡小麦种子8h,7d后小麦根系琥珀酸脱氢酶活性提高65.27%,经蛋白处理的小麦根长比对照提高13.1%。

极细链格孢菌HZ-1对阔叶杂草的致病性及对作物的安全性评价

采用形态学结合分子鉴定的方法,对生防潜力菌株HZ-1进行分类学鉴定,通过菌株发酵液致病性测定,评价该菌株对5种阔叶杂草的除草活性,采用盆栽生测法评价其对青海省主栽作物的安全性。结果表明,HZ-1为极细链格孢菌(Alternaria tenuissima),菌株发酵液对猪秧秧(Galium aparine)、刺儿菜[Cephalanoplos setosum(Willd.)Kitam]、藜(Chenopodium album)、冬葵(Malva crispa)、酸模叶蓼(Polygonum lapathifolium L.)表现出不同程度的致病作用,尤其对猪秧秧、藜致病效果最为突出。安全性评价结果显示,该菌株除对春油菜有轻微影响外,对春小麦、蚕豆、豌豆和青稞4种作物相对安全。综上,HZ-1可作为防除猪殃殃、藜等阔叶杂草生物除草剂的候选菌株。

以G418为筛选标记的极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)原生质体转化体系的建立

[目的]建立极细链格孢菌（Alternaria tenuissima）的原生质体遗传转化体系。[方法]采用酶解法制备极细链格孢菌的原生质体，并通过PEG/CaCl2介导的化学方法将含有G418抗性标记的DNA转入极细链格孢菌原生质体。[结果]转化子生长表型及其基因组DNA的PCR检测表明抗性基因已成功整合到极细链格孢菌基因组中。该方法的转化率达3-4个转化子/μg转化DNA。所获得的转化子在无选择压力下连续培养3代，G418抗性仍能稳定遗传。[结论]成功建立了极细链格孢菌的遗传转化系统，为极细链格孢菌的基因功能研究奠定了基础。

极细链格孢菌剂的初步研制及其除草作用研究

本研究选用一株具有除草活性的生防菌株极细链格孢Alternariatenuissima HZ-1作为研究对象,通过载体和助剂的筛选,初步研制出可湿性粉剂,并对杂草离体叶片、盆栽杂草及田间小区杂草的致病效果进行了测定。结果表明,HZ-1最适载体为高岭土,助剂为羧甲基纤维素、可溶性淀粉和白炭黑,菌株HZ-1可湿性粉剂对不同杂草离体叶片致病性表现为:密花香薷>冬葵>野燕麦>薄蒴草>酸模叶蓼>藜>萹蓄。盆栽致病性结果显示,HZ-1可湿性粉剂对薄蒴草、藜和密花香薷致病效果突出,对冬葵和酸模叶蓼次之,对萹蓄、野燕麦无效。小区试验显示对繁缕、藜和密花香薷有显著除草效果。该菌株可作为防除薄蒴草、藜、密花香薷和繁缕等杂草的生物除草剂进行进一步研究。

除草活性菌株极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)发酵工艺研究

【目的】探索一株防治藜、冬葵等阔叶杂草的生防菌株极细链格孢(Alternaria tenuissima)HZ-1的发酵工艺.【方法】采用液固双相发酵方式,通过单因素和正交设计试验,对该菌株固态发酵基质、最适碳氮源和固-液发酵条件进行研究.【结果】HZ-1最佳产孢的固态基质为麦麸,最适碳源为麦麸(40 mg/g),最适氮源为蛋白胨(50 mg/g).正交优化试验得出该菌最适固-液发酵条件为:培养基初始含水量为300 mg/g,适宜的接种量为0.3 mL/g,初始pH值7.4,最适温度为24.3℃,发酵最适时间为216 h.【结论】研究结果可为该极细链格孢菌菌株除草活性物质的分离及工业化生产提供依据.

极细链格孢蛋白激发子对抗虫杂交棉生理特性和产量影响的研究

研究了极细链格孢蛋白激发子对"湘杂棉3号"主要生理特性和产量的影响,探讨抗虫杂交棉高产措施的生理机制,为高产栽培提供理论依据。分析极细链格孢蛋白激发子对棉花生理特性的影响。结果表明,在湖南气候条件与栽培技术体系下,细极链格孢菌蛋白激发子(PEAT)能显著提高棉花叶片光合速率,果枝叶叶绿素含量,同时提高了叶片可溶性蛋白质、可溶性糖含量,增强棉花生理机能;从生理生化活性来分析,极细链格孢菌蛋白激发子诱导后SOD、POD及MDA含量均有不同程度的变化,SOD、POD活性增强,而MDA活性降低,能起到延缓植株衰老的作用;从产量分析来看,极细链格孢菌蛋白激发子诱导后,显著提高单铃重、棉花产量,浸种+幼苗期喷施+现蕾期喷施+初花期喷施处理产量为1 781.44 kg/hm2,浸种+幼苗期喷施+现蕾期喷施处理产量为1 767.61 kg/hm2,比清水对照分别高出43.7%、42.5%,达到极显著水平。说明极细链格孢蛋白激发子能增强抗虫杂交棉生理机能、延缓棉株衰老、提高产量。

极细链格孢菌66kDa激活蛋白的纯化及诱导烟草抗TMV的功能

激活蛋白是一类来源于真菌、诱导植物获得系统抗性的蛋白激发子。通过加热离心、乙醇沉淀、离子交换层析、超滤等方法,从极细链格孢菌(Alternaria tenuissi ma)JH505菌株的菌丝体中分离纯化出一种激活蛋白,在SDS-PAGE银染图谱显示单一条带,表观分子量约为66 kDa,糖蛋白特异性染色确定其为糖蛋白。该蛋白可以诱导三生烟提高对烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的抗性,处理后的三生烟叶片TMV枯斑数显著减少,枯斑抑制率可达到49%。

7%井冈霉素·极细链格孢激活蛋白可湿性粉剂对烟草病毒病的防效研究

连续2年对7%井冈霉素·极细链格孢激活蛋白可湿性粉剂不同用量、10%宁南霉素可溶性粉剂和5%井冈霉素可溶性粉剂防治烟草病毒病进行了田间药效试验，结果表明：7%井冈霉素·极细链格孢激活蛋白可湿性粉剂600-800倍液对烟草病毒病有较好的防治效果，防效在60%以上。

极细链格孢菌peaT1基因在毕赤酵母中的表达与功能分析

建立了在毕赤酵母(Pichiapastoris)中分泌表达PeaT1蛋白的技术。将来源于极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)的基因peaT1亚克隆至酵母分泌型表达载体pPIC9K,构建了重组表达载体pPIC9K-peaT1,分别用SalI或BglII酶切线性化后电击转入毕赤酵母GS115菌株中,经MD平板筛选、PCR鉴定获得整合有外源基因的重组菌株。在α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,PeaT1在酵母中大量表达并分泌到胞外,SDS-PAGE检测表明表达蛋白的表观分子量约为35kD。表达蛋白上清稀释液能诱导烟草产生对TMV的抗性,其枯斑数抑制率可达到30.37%。每升表达上清液经超滤浓缩和离子交换层析可纯化目的蛋白16.13mg,该纯化蛋白能显著地促进小麦幼苗的生长。

树莓极细链格孢菌叶斑病病原菌鉴定及其生物学特性

从贵州省贵阳市树莓园的受害树莓叶片分离出致病菌S1,经致病性测定,形态学和分子生物学rDNA-ITS序列相似性分析,鉴定病原菌S1为极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)。采用控制单一变量法研究树莓极细链格孢菌叶斑病病原菌生物学特性,以期为由该致病菌所引起的树莓病害防治提供参考依据。结果表明:病原菌S1于25℃的恒温环境中生长最好,15℃时产孢量最高;最适生长pH为11,最适产孢pH为7;在24 h持续黑暗的环境中生长速度最快,产孢量最高的光照条件为半光照;碳源分别为淀粉和乳糖时生长最好和产孢量最高;以牛肉膏为氮源时生长最好,添加酵母粉时产孢量最多;在树莓煎叶培养基中生长最快,产孢量最多的培养基是PDA。

提高蛋白激发子产量的培养基及发酵条件的优化

为了进一步提高极细链格孢菌产蛋白激发子的产量,通过单因子和多因子试验与分析,筛选优化了适于极细链格孢菌产生蛋白激发子的培养基和培养条件,并检测了发酵过程中pH、还原糖、氨基氮和菌丝量变化以及与蛋白激发子产量的关系。结果表明,土豆淀粉和黄豆粉对蛋白激发子产量影响最大,其次是蛋白胨和无机盐。优化的发酵培养基主要成分(g/L):碳源Ⅰ15、葡萄糖5、玉米淀粉5、土豆淀粉20、谷氨酸10、氮源Ⅰ5、黄豆粉10、硫酸铵5。确定了优化的培养条件,调整培养基起始pH为7.0～7.5,将18h菌龄的种子培养液按10%接种量接种到装液量为75mL的500mL摇瓶中,在温度(28±1)℃、摇床转速180r/min下培养可获得理想的蛋白产量。在优化的培养基和培养条件下,发酵12～48h该菌进入对数生长期,48h进入稳定生长期,60h菌丝和蛋白激发子产量达最高。蛋白产量与菌体生物量呈正相关,当还原糖、总糖量消耗到最低水平时,菌丝产量和蛋白激发子产量达最高。优化的培养基菌丝干重收率达3.9g/100mL,蛋白激发子产量达到5.17g/L,比普通的土豆液体培养基提高近4倍。

我国华北区甜菜苗期未知叶斑病害的诊断鉴定

对2014年我国河北省和内蒙古两地甜菜种植区纸筒育苗苗期甜菜叶片上出现的新的叶部枯斑病害,利用马铃薯葡萄糖琼脂培养基分离、培养、保存病原菌。结合分离菌落形态,提取发病叶片或分离的菌株菌丝DNA,利用真菌检测的通用引物ITS1及ITS4检测结果得到长541 bp单一条带,并测序。无论是直接提取病叶DNA的PCR产物测序还是分离的病原菌提取菌落DNA测序得到的序列相同,NCBI比对结果为极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)。进一步利用组蛋白3基因引物H3-1a和H3-1b扩增分离物菌丝DNA结果得到600 bp左右单一条带,测序结果同真菌通用引物检测结果一致。采用甜菜叶片涂抹法接种进行致病性试验出现了相同的叶斑症状,并从接种后出现病害症状的叶片上分离检测确认了病菌。因此,从河北和内蒙采集的甜菜苗期叶部病害病原菌为极细链格孢菌,为有效控制此类病害、减轻甜菜损失提供了理论指导。

水蜡叶斑病病原菌鉴定及对药剂的敏感性

[目的]为明确水蜡叶斑病致病菌,为其防治提供依据。[方法]采用柯赫氏法则、形态学测定、r DNA-ITS序列比对鉴定,研究了致病菌的分类地位;测定了病菌对不同杀菌剂的敏感性。[结果]水蜡叶斑病致病菌是极细链格孢菌(Alternaria tenuissima),测定了病菌对12种杀菌剂的敏感性。结果表明:10%苯醚甲环唑WP、30%氟菌唑WP、125g/L氟环唑SC对菌丝的敏感性较高,EC50值分别为14.36、37.91、29.86 mg/L;对孢子的敏感性较高,EC50值分别为125.81、245.73、207.03 mg/L。[结论]明确了水蜡叶斑病致病菌种类,筛选的3种杀菌剂可有效抑制病害的发生。

青岛市番茄早疫病病原菌鉴定及防治药剂筛选

2016年,山东青岛地区番茄早疫病发生严重,危害较大。为明确引起番茄早疫病的病原菌,以番茄早疫病病叶为试材,采用组织分离、菌物形态学特征并结合rDNA-ITS和His基因序列分析等分子检测方法,对病原菌进行了分离鉴定。结果表明:引起青岛市城阳区番茄早疫病的病原菌为极细链格孢(Alternaria tenuissima)。此外,采用菌丝生长速率法,研究了在室内离体条件下极细链格孢对吡唑醚菌酯、戊唑醇、丙环唑、咪鲜胺4种杀菌剂的EC_(50)值,以期筛选出防治番茄早疫病高效低毒杀菌剂,为番茄早疫病防控提供参考依据。药效试验结果表明,4种杀菌剂对极细链格孢的生长均有抑制作用,但不同药剂之间存在差异。极细链格孢对吡唑醚菌酯、戊唑醇、丙环唑、咪鲜胺的EC50值分别为1.088、1.684、3.924、0.476mg·L^(-1)。其中以97%咪鲜胺原油抑制效果最佳,97%吡唑醚菌酯原粉、98%戊唑醇原粉次之,97%丙环唑原油抑制效果最差。