枯草芽孢杆菌分泌表达极耐热木聚糖酶及其酶学性质

为将海栖热袍菌极耐热木聚糖酶基因xyn B（Gen Bank登录号AY340789）在枯草芽孢杆菌Bs916中进行异源分泌表达,并阐明工程菌分泌重组木聚糖酶的酶学性质。克隆极耐热木聚糖酶基因xynB,将其与罗克霉素启动子融合,构建融合质粒载体pXYNB2,将其转化到枯草芽孢杆菌Bs916中,获得重组枯草芽孢杆菌（Bs916/p XYNB2）,并对重组芽孢杆菌分泌表达的极耐热木聚糖酶的酶学性质进行了研究。SDS-PAGE法测定重组枯草芽孢杆菌分泌的蛋白在相对分子质量43 000处有明显的蛋白表达条带。重组木聚糖酶的最适反应p H值为5.0-5.8,重组木聚糖酶的最适反应温度大于或等于100℃,重组极耐热木聚糖酶在pH值4.6-7.8比较稳定,重组木聚糖酶的温度稳定性在90℃下保温2 h后残存酶活83%。可见,生防枯草芽孢杆菌Bs916能有效分泌表达极耐热木聚糖酶,为以后构建多种纤维素和半纤维素在其中的协同表达,拓宽其碳源利用范围奠定基础。

大肠杆菌生产重组极耐热木聚糖酶的诱导条件及其酶学性质

构建重组菌(JM109/pTrc 99A xylIV)作为极耐热木聚糖酶的生产菌株,研究了IPTG诱导时间、IPTG浓度、重组菌生长的不同阶段加IPTG和温度对重组菌生产极耐热木聚糖酶的影响以及它的酶学性质.结果表明,IPTG诱导8h后极耐热木聚糖酶的表达量基本维持不变,0.5～5mmol/L浓度的IPTG诱导重组菌表达极耐热木聚糖酶的效果基本相同;当重组菌生长到OD600为1.2左右时加IPTG诱导最好,诱导温度对极耐热木聚糖酶表达水平的影响不大.重组耐热木聚糖酶的最适反应pH值为5.4～5.8,重组极耐热木聚糖酶的最适反应温度大于100℃,重组极耐热木聚糖酶在pH值4.2～7.5都比较稳定,重组极耐热木聚糖酶的温度稳定性好,在90℃下保温2h后残存酶活还有90%.

极耐热性阿拉伯糖苷酶在木糖制备中的应用

阿拉伯糖苷酶作为木聚糖降解的限速酶之一,在植物残体的生物转化、食品加工、饲料工业以及纸浆漂白中具有广泛的应用潜力。实验中选择pET—28a作为表达载体,优化核糖体结合位点RBS与起始密码子ATG间距离,使来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)极耐热性阿拉伯糖苷酶得到高效表达,重组酶蛋白经一步热处理后纯度达到90%以上;木聚糖酶解试验结果表明,阿拉伯糖苷酶和木聚糖酶间存在协同作用;阿拉伯糖苷酶与木聚糖酶和β-木糖苷酶联合水解木聚糖能明显提高酶解产物中木糖含量,因此,开发极耐热性阿拉伯糖苷酶在酶法制备木糖中的应用具有重要的经济效益和社会效益。

极耐热双功能酶的表达纯化及性质研究

将含海栖热袍菌（Thermoga maritima）β-木糖苷酶（Xyl）基因的重组质粒p ET-28a-xyl导入大肠杆菌BL21-Codon Plus（DE3）-RIL中,经诱导实现高效表达,经热处理和Ni2＋亲和层析纯化达到电泳均一,并对纯化的重组酶Xyl的酶学性质进行研究。结果表明,重组Xyl同时具有木糖苷酶和阿拉伯糖酶活性,即为双功能酶。以对硝基苯酚-ɑ-阿拉伯呋喃糖苷（p NPAF）作为底物,重组酶Xyl的最适作用温度和最适p H分别为80～90℃和5.8,90℃的半衰期为1.0 h,在pH 7.0～7.8区间重组酶保持较高的稳定性。金属离子Mn2＋对重组Xyl的双活性有促进作用,而Cu2＋和SDS对酶的抑制作用最明显。重组Xyl能将低聚木糖中的木二糖和木三糖彻底分解为木糖。

极端耐热木聚糖酶基因在大肠杆菌中的高效表达

海栖热袍菌Thermotogamaritima为嗜极端高温的厌氧细菌 ,其产生的极耐热性木聚糖酶B具有非常可观的工业应用前景。但编码该酶的基因xynB在大肠杆菌中的表达较困难。文中利用PCR技术将xynB克隆至原核表达载体pET 2 0b ,并与组氨酸标签进行融合构建成重组质粒 pET 2 0 xynB。研究发现 ,pET 2 0 xynB在稀有密码子AGA ,AGG和AUA得到加强的大肠杆菌宿主菌株BL2 1 CodonPlus(DE3 ) RIL中 ,木聚糖酶基因的表达水平远远高于在其他菌株中的表达。结合对重组菌的诱导条件的优化 ,使得重组蛋白表达量达到11 5 % ,比酶活达到 2 5 69U/mg ,比常规基因工程菌株提高 12 5倍。

极耐热性乳酸脱氢酶高效表达、纯化及酶学性质

从海栖热袍菌扩增出编码乳酸脱氢酶的基因并将其插入热激载体pHsh构建表达质粒,在大肠杆菌Escherichia coli中进行表达产生极耐热性乳酸脱氢酶Tm-LDH。基因表达产物通过热处理,可以一步获得接近电泳纯的重组酶。酶学性质研究表明,Tm-LDH的最适反应温度为95℃,最适pH 7.0;纯酶在90℃的半衰期为2 h,在pH 5.5–8.0之间最稳定;SDS-PAGE结果显示分子量为33 kDa,与理论推算值相吻合。以丙酮酸和NADH为底物时,相对于丙酮酸的Km值1.7 mmol/L,Vmax为3.8×104 U/mg;相对于NADH的Km值7.2 mmol/L,Vmax值为1.1×105 U/mg。Tm-LDH基因在T7载体中未能实现高效表达,但是在热激载体pHsh中得到了可溶性超量表达,表达水平达到340 mg/L。该酶在65℃反应条件下,活性达到最高活性的50%,并能保持活性不变,这使该酶能够与常温酶匹配,在辅酶NAD再生体系的建立中具有广泛的用途。

Effect of metallic content on mechanical property of Ni/(10NiO-NiFe_2O_4) cermets

Ni/ （10NiO-NiFe2O4） cermets were fabricated by using cold pressing-sintering method. The phase composition and effect of metallic content on the mechanical properties such as bending strength, Vickers’ hardness, fracture toughness and thermal shock resistance were studied. The results show that the cermets consist of Ni, NiO and NiFe2O4. Within the range of metallic content from 0 to 17%（mass fraction）, the relative density decreases with the increase of metallic content and the decrease of sintering temperature, Vickers’ hardness decreases from 7097MPa to 4814MPa and the bending strength increases from 110MPa to 157MPa, and the fracture toughness reaches the optimal value of 5.11MPa·m 1/2 at the metallic content of about 10%. The residual strength after thermal shock testing falls sharply as the thermal shock temperature difference is above 200℃.The cermets samples, whose metallic content is 10% and 15%, respectively, exhibit promising property of thermal shock resistance at 960℃ with six cycles of heating and quenching testing.