极耐热性乳酸脱氢酶高效表达、纯化及酶学性质

从海栖热袍菌扩增出编码乳酸脱氢酶的基因并将其插入热激载体pHsh构建表达质粒,在大肠杆菌Escherichia coli中进行表达产生极耐热性乳酸脱氢酶Tm-LDH。基因表达产物通过热处理,可以一步获得接近电泳纯的重组酶。酶学性质研究表明,Tm-LDH的最适反应温度为95℃,最适pH 7.0;纯酶在90℃的半衰期为2 h,在pH 5.5–8.0之间最稳定;SDS-PAGE结果显示分子量为33 kDa,与理论推算值相吻合。以丙酮酸和NADH为底物时,相对于丙酮酸的Km值1.7 mmol/L,Vmax为3.8×104 U/mg;相对于NADH的Km值7.2 mmol/L,Vmax值为1.1×105 U/mg。Tm-LDH基因在T7载体中未能实现高效表达,但是在热激载体pHsh中得到了可溶性超量表达,表达水平达到340 mg/L。该酶在65℃反应条件下,活性达到最高活性的50%,并能保持活性不变,这使该酶能够与常温酶匹配,在辅酶NAD再生体系的建立中具有广泛的用途。