抗端粒酶核酶质粒的构建筛选及其对CNE-2Z细胞增殖与凋亡的影响

背景与目的:已证实端粒酶(telomerase,TLMA)对肿瘤的进展和肿瘤细胞的无限增殖起着重要的决定作用。核酶是具有特殊核酸内切酶活性的反义RNA,可序列特异性地与靶RNA分子配对并切割靶基因RNA。有报道人低分化鼻咽癌CNE-2Z细胞端粒酶阳性,本实验目的是构建抗端粒酶RNA模板区特异性核酶的真核表达载体并用电穿孔法将其导入人低分化鼻咽癌CNE-2Z细胞,研究该核酶对CNE-2Z细胞增殖、凋亡的影响。方法:设计合成针对端粒酶RNA模板区的锤头状核酶基因teloRZ作为端粒酶抑制剂,构建3种带有绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)报道基因和嘌呤霉素(puromycin)抗性基因的teloRZ真核表达质粒pGFPuro-teloRZ2.1、pGFPuro-teloRZ7.1、pGFPuro-teloRZ7.7,这3种质粒的不同点在于teloRZ基因和puromycin抗性基因按3种不同方向设计,然后将上述3种质粒及载体质粒pPAT-GFP电转染CNE-2Z细胞,用荧光显微镜检测GFP表达情况;用流式细胞仪、荧光染色法检测细胞增殖指数及凋亡等指标。结果:CNE-2ZGTR7.1细胞(转染目的基因质粒pGFPuro-teloRZ7.1的CNE-2Z细胞)增殖指数(25.100±0.141)%明显低于CNE-2Z细胞(未转染质粒的细胞)的(53.663±16.981)%、CNE-2ZG细胞(转染空载质粒pPAT-GFP的CNE-2Z细胞)的(61.575±5.166)%、CNE-2ZGTR2.

APOC3表达抑制剂筛选模型的构建及意义

目的构建APOC3表达抑制剂筛选模型,并从中药单体化合物中筛选APOC3表达抑制剂。方法利用PCR方法扩增APOC3基因启动子,利用基因重组技术构建启动子驱动的荧光素酶报告载体;通过荧光素酶活性检测筛选APOC3表达抑制剂;利用RT-qPCR方法检测APOC3的mRNA表达水平,利用Western blot方法检测APOC3的蛋白表达水平;利用oxLDL诱导肝细胞中的脂质沉积,之后利用油红O染色法检测细胞内的脂质沉积情况。结果APOC3表达抑制剂筛选模型构建成功,用该筛选模型筛选中药单体化合物,发现千层纸素A可抑制APOC3基因启动子活性,并进而抑制APOC3 mRNA和蛋白的表达水平。进一步的研究显示,千层纸素A可抑制oxLDL诱导的肝细胞中的脂质沉积。结论本研究构建的筛选模型可用于APOC3表达抑制剂的筛选,且筛选到的化合物千层纸素A可抑制脂质沉积。

胰腺癌人源噬菌体单链抗体库的构建及初步筛选

提取胰腺癌患者的外周淋巴细胞总RNA,以RT-PCR技术分别扩增出人源抗体H链和L链的可变区基因,采用SOE-PCR法将VH和VL片段随机拼接成scFv片段,然后将scFv片段克隆至pCANTAB5E载体,并电转化至感受态TG1菌,经辅助噬菌体M13K07拯救,获得胰腺癌人源噬菌体单链抗体库。结果表明,从外周血淋巴细胞中获取可变区基因,利用噬菌体抗体库技术制备人源抗胰腺癌单链抗体的策略是可行的。

猪蛔虫卵可溶性抗原单链抗体库的构建及初步筛选

为进一步研制抗猪蛔虫的高特异性、高亲和力的基因工程抗体奠定基础,以猪蛔虫未成熟虫卵可溶性抗原免疫BALB/C小鼠,提取小鼠脾脏总RNA,以RT-PCR技术分别扩增出H链和L链可变区基因,以SOE-PCR法将VH和VL片段随机拼接成ScFv片段,然后将ScFv片段克隆至pCANTAB-5E载体,并转化至感受态TG1菌,经辅助噬菌体M13K07拯救,构建猪蛔虫卵可溶性抗原噬菌体展示单链抗体库,结果从20个噬菌体克隆中筛选到15个阳性克隆。

抗蛔虫人源单链抗体库的构建及鉴定

目的:构建抗蛔虫人源单链抗体库,从中筛选建抗蛔虫人源特异性单链抗体.方法:分离10个患蛔虫病人的淋巴细胞,提取总RNA反转录为cDNA,PCR扩增人抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,采用SOE-PCR法将VH和VL片段随机拼接成scFv片段,并克隆入噬菌粒载体pCANTAB5E中,构建噬菌体单链抗体库.结果:初级库库容量为1.8×106,在大肠杆菌TG1中重组后得到1.6×106的次级抗体库.结论:本研究成功构建抗蛔虫人源单链抗体库,拟在为蛔虫病的预防、诊断、治疗奠定基础.

基于随机森林的多站融合项目优先业务筛选机制

在“双循环”新发展格局和“电力数字化”战略中顺势发展“多站融合”项目。基于多站融合布局,提出了一个多站融合项目区域性优先业务筛选的技术方法,从经济发展与能源产业视角,依据各区域属性特征将中国31个省市划分为四类区域,并结合多站融合项目业务清单所梳理的三大类业务范畴,利用随机森林算法的大数据分析法,通过选择区域数据样本,形成了多站融合项目区域性优先业务筛选机制,进而依据优先业务匹配组合预测,实现了各区域优先发展业务的精准甄别和科学选择。实证分析验证了基于随机森林算法的多站融合项目区域性优先业务筛选模型的科学合理性以及有效可靠性,以期为多站融合推进提供有益参考。

汉滩病毒M片段噬菌体表位文库的构建及筛选

目的通过构建汉滩病毒M片段的噬菌体展示文库,筛选汉滩病毒包膜蛋白的抗原表位。方法DNaseⅠ随机消化的M片段与载体pComb3连接,转化宿主XL-1Blue,在辅助噬菌体VCSM13存在的条件下,获得M片段的随机噬菌体文库。利用纯化的恢复期病人血清对M片段噬菌体文库进行3轮淘洗,通过ELISA、序列分析对所获得的克隆进行鉴定。并对其中2个阳性克隆的目的片段进行了原核表达和免疫原性分析。结果筛选获得的5个阳性噬菌体克隆均位于G1蛋白编码区,原核表达的2个阳性克隆片段蛋白免疫兔,免疫兔血清能与病毒抗原发生特异反应。结论本技术路线可用于汉滩病毒包膜蛋白抗原表位的研究,为汉滩病毒诊断试剂的研制、亚单位疫苗的设计提供了数据。

宏基因组学：热带冬季瓜菜病害生物防治新策略

微生物及其活性产物在植物病害防治中的作用日益凸显,加快了人们对其的研究和开发利用。然而,传统纯培养技术获得的微生物不足环境总量的1%,99%以上的微生物尚不能培养,阻碍了人们对其结构和功能多样性的研究。近年,随着宏基因组技术的发展,大量非培养来源的活性物质被挖掘并应用于病害防治,为微生物基因资源及其活性产物的研究和应用开辟了新的途径。本文就宏基因组学研究过程:宏基因组DNA提取、文库构建和筛选、高通量测序和序列分析等进行了回顾,探讨了宏基因组学在生物防治中的重要作用,并对宏基因组学这门新型的学科在热带冬季瓜菜病害生物防治中的应用前景进行了展望。