番茄果实特异性启动子2A11的基因克隆及功能研究

采用巢式PCR技术从番茄基因组DNA克隆到长度1.3kp的果实特异性2A11启动子基因。序列分析表明,克隆到的基因序列2A11启动子转录起始位点上游的621bp处缺失了已报道的番茄2A11启动子基因(GenBankIDM87659,1993)序列中的“tatattgttaacttcttgttgaattaaagcaat”片段,其同源性为61%,登入GenBank,ID号为DQ453963;构建植物表达载体pCAMBIA2A11,用农杆菌介导侵染番茄果实,GUS基因瞬间表达结果表明,该2A11启动子基因具有驱动GUS基因在番茄果实中特异性表达的功能。研究结果表明成功地获得2A11果实特异性启动子基因,为下一步转基因番茄口服疫苗的研制奠定了一定的基础。

果实特异性启动子驱动丙型肝炎病毒E2基因植物表达载体的构建

构建了果实特异性启动子驱动的含编码丙型肝炎病毒包膜蛋白E2基因的植物表达载体,为研制有效的转基因植物丙肝疫苗打下基础。以载体pCAMBIA2300为骨架引入pBIl21中的GUS基因,用目的片段E2基因替换其中的GUS基因构建了pCAM-BIA2300G-E2载体,将番茄的果实特异性启动子E8引入pCAMBIA2300G-E2载体中构建了pE8-E2植物表达载体。用限制性内切酶消化重组载体,结果表明重组载体都含有所插入的目的片段。果实特异性启动子驱动的含E2基因的植物表达载体的成功构建,为抗丙型肝炎病毒的口服疫苗研究提供了试验基础。

番茄果实特异性E8启动子的基因克隆与序列分析

目的获取番茄果实特异性E8启动子基因,为实现外源基因在转基因番茄中果实特异性表达做准备。方法培养中蔬5号(Zhongshu No.5)番茄幼苗, 采集叶片,用Omega公司的植物基因组提取试剂盒提取番茄基因组DNA;设计引物,从基因组中通过PCR扩增获得番茄果实特异性E81.1和E82.2启动子基因;克隆进pGEM-T载体,酶切鉴定;送上海基康公司测序;序列分析。结果从番茄基因组DNA中PCR扩增得到预期大小的启动子片段;构建重组pGEM-T-E81.1和pGEM-T-E82.2载体,经酶切证实具有与目标片段长度相符的插入片段;测序结果分析显示:番茄果实特异性E8启动子序列高度保守,所获得的Zhongshu No.5 E82.2启动子DNA序列与Deikman报道的Cherry种的E82.2启动子同源性为99%, 登陆GenBank, ID号为AF515784。结论成功获得Zhongshu No.5番茄果实特异性E81.1、E82.2启动子基因,为下一步转基因番茄口服疫苗的研制奠定了一定的工作基础。

香蕉果实特异性ACC合酶基因启动子区的克隆及其功能初探

根据本实验室所获得的香蕉果实特异性ACC合酶cDNA序列 ,以改进的接头连接PCR方法通过两次步行从香蕉基因组中分别扩增并克隆了其基因 5′旁侧区近端 1 2kb和远端 1 6kb的片段。通过拼接 ,构建出含有2 5 0 5bp启动子区和转录起始位点下游 86bp的共 2 5 91bp的基因 5′旁侧区片段 ;其启发性动子区中 34至 2 8为推测的TATA盒序列 , 15 8至 146为推测的CCAAT盒 ,与其它植物基因启动子结构相类似。将 2 5kb启动子片段与 β 葡糖苷酸酶 (GUS)基因编码序列融合 ,用基因枪法将构建的嵌合基因转入香蕉叶、根和果实的细胞后 ,只在果实细胞中观察到报告基因的瞬时表达 ,从功能上证明了此 2 5kb的启动子片段具有指导报告基因在香蕉果实中特异性表达的作用。同时构建 5个含不同 5′端缺失启动子与GUS融合基因的表达载体。瞬时表达结果表明可能负责果实特异性表达的调控区存在于转录起始位点至 - 1111的启动子区中 ,而在 - 1111至 - 6 0

甜瓜果实特异性表达黄瓜素基因启动子区的克隆和序列分析

黄瓜素(cucum is in)是甜瓜类枯草杆菌丝氨酸蛋白酶,其表达具有果实特异性.应用PCR方法从甜瓜基因组DNA中扩增出该基因自转录起始位点至上游一段长310 bp片段,并将其克隆到pUC 19载体中,序列分析表明该序列与已报道的相应序列完全相同,且具有TATA-box、CAAT-box、G-box、I-box-like和增强子元件TGTCACA等功能域,具有典型的果实特异性启动子特征.成功获得甜瓜果实特异性表达基因的启动子,为下一步实现外源基因在甜瓜果实中特异表达奠定基础.

不同肌肉特异性启动子IGF2表达载体构建及对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响

旨在获得带有高效特异性启动子的IGF2表达载体,研究其对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响。本研究将构建的3种含有IGF2肌肉特异性启动子的真核表达载体转染牛骨骼肌卫星细胞和胎儿成纤维细胞,RT-PCR检测IGF2的相对表达量,从而筛选高效特异性的载体,并进行EdU试验及细胞周期相关基因RT-PCR检测。结果,成功构建了不同启动子desminpro、CMV-MyoGpro和MyoGpro-double表达IGF2的载体。RT-PCR检测结果表明,pGL3-desminpro-IGF2是较高效的并具有特异性的载体。载体转染体外培养细胞提高了细胞增殖速度,并上调了细胞周期相关基因CDK6和IGF2的表达。这为转基因肉牛的生产奠定了重要基础。

果实特异性启动子驱动的含sbr基因植物高效表达载体的构建

目的构建果实特异性启动子驱动的含编码变形链球菌唾液粘附区(sbr)植物表达载体,进一步提高外源目的基因的表达,为研制有效的转基因植物防龋疫苗打下基础。方法提取番茄基因DNA,利用PCR技术扩增果实特异性启动子E8和2A11基因,双酶切质粒PROP及PROSC,分别与目的基因连接,构建重组植物表达载体。结果通过双酶切鉴定,目的基因片段已正确整合到植物表达载体中。结论本实验成功构建了果实特异性启动子驱动的含sbr基因的植物表达载体。

嗜上皮细胞特异性启动子ED-L2转基因小鼠的建立

目的 :利用ED L2启动子构建载体 ,建立鼻咽癌转基因动物模型 .方法 :将ED L2 pEGFP质粒用XhoI酶切线性化 ,胶回收线性化片段 ,稀释浓度 4mg·L-1 ,采用显微注射法 ,将外源基因注射入小鼠受精卵细胞内 .结果 :产 1 2只小鼠 ,PCR检测基因整合 ,其中阳性 9只 ,阳性率 75 % ,SouthernBlot检测阳性 2只 ,阳性率 1 6 .6 7% .结论 :嗜上皮细胞特异性启动子ED

植物果实特异性启动子E8基因的克隆

采用高盐低pH值法、分步离心法、SDS法、CTAB法、改良CTAB法提取毛粉802番茄幼苗基因组DNA,其中改良CTAB法提取的DNA效果最好,以此DNA为模板,用特异性引物进行PCR扩增,得到了预期大小的片段,将目的片段回收,克隆进pMD18-T Simple Vector载体,经PCR及酶切检测具有与目标片段长度相符的插入片段,构建的重组pMD18-E8载体经测序结果分析显示,番茄果实特异性E8启动子序列具有高度保守性,与GenBank上发表的E81.1启动子同源性为99.1%,说明成功获得了果实特异性E8启动子基因,为实现外源基因在转基因桃果实中特异性表达做准备。

灵芝-8基因的番茄果实特异性启动子植物表达载体的构建

构建含有灵芝-8(LZ-8)基因和番茄果实特异性E8启动子的重组载体,并将其转化到根瘤农杆菌中。通过PCR法获取LZ-8基因和E8启动子序列,将目的基因和E8启动子序列构建到植物表达载体pB I121中,获得果实特异性表达LZ-8蛋白的重组质粒。并采用PCR、限制性内切酶酶切和序列测定分析法,对重组质粒进行鉴定,将其转入根瘤农杆菌GV3101中。PCR法、限制性内切酶酶切图谱和序列测定分析均表明番茄果实特异性表达LZ-8蛋白的重组质粒构建成功。获得了含有LZ-8基因和E8启动子的重组质粒,并成功转化根瘤农杆菌,为下一步LZ-8蛋白在番茄果实中特异表达奠定基础。

番茄果实特异性启动子驱动下的乙肝表面抗原S基因的植物表达载体的构建

将番茄果实特异性启动子通过PCR的方法扩增出来,然后将其替代了pBIN438的CaMV35S启动子,并将乙肝表面抗原的S基因连接到载体上,以获得番茄果实特异性表达乙肝表面抗原的高效植物表达载体。

西瓜果实特异启动子WSP功能区域的初步定位

西瓜AGPase的大亚基基因wml1的 5′端上游 15 73bp序列 ,是一个果实特异性启动子 (命名为WSP)。根据WSP内部酶切位点 ,获得了 3个不同 5′端缺失的启动子片段 (长分别为 12 0 1bp、898bp、795bp) ,并构建成植物瞬间表达载体 ,与含WSP的瞬间表达载体一起用基因枪的方法转入西瓜叶、茎、花及不同发育期果实中。瞬时表达结果表明 ,15 73bp、12 0 1bp、898bp的片段均能指导GUS基因在西瓜果实和花中特异性表达 ,但是表达强度和表达时期有所不同 ,795bp的片段不能指导GUS基因表达。推测在 180bp 5 5 1bp之间可能存在促进外源基因在果实发育后期表达的顺式作用元件 ,而果实特异调控区域可能位于 85 4bp 95 7bp之间。

玉米PLATZ基因GRMZM2G006585启动子的克隆及表达分析

高转录活性籽粒特异性启动子可调控目的基因在植物籽粒中特异性、高水平表达。为发掘玉米籽粒特异性启动子,以公开发表的玉米表达谱芯片数据为切入点,筛选出籽粒优势表达基因GRMZM2G006585,克隆其编码区上游约2000 bp的DNA序列,命名为PZm2G006585。利用在线网站New PLACE和PlantCARE对其进行启动子顺式作用元件分析,发现其含有E-box、P-box等多个籽粒特异性相关元件,初步认为所克隆编码区上游序列为玉米来源的籽粒特异性启动子。为验证其功能,构建该启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的表达载体并进行植物遗传转化。转基因水稻的GUS组织化学染色结果表明,该启动子驱动外源基因表达模式为籽粒特异、胚优势表达;转基因拟南芥单拷贝株系T_(3)种子中GUS活性检测结果显示,PZm2G006585驱动的GUS活性为909.52 nmol/(min·mg)。籽粒特异性启动子PZm2G006585的发掘和功能验证为驱动目标基因在玉米、水稻等单子叶植物籽粒中特异性表达提供了候选启动子资源。

地上部特异性启动子驱动番茄原系统素表达的载体构建及转基因植株的获得

克隆地上部特异表达的启动子——cab2(chlorophyll a/b binding protein 2,cab2)基因的启动子,构建该启动子驱动下的番茄原系统素(Prosystemin;PS)与GFP融合的植物表达载体并获得转基因植株。利用农杆菌介导法转化拟南芥,通过RT-PCR的方法及激光共聚焦显微镜观察启动子驱动PS-GFP的表达及其亚细胞定位。以拟南芥基因组为模板,利用高保真聚合酶获得了cab2启动子的目的片段,并将其与接GFP的番茄原系统素载体(SlPS)融合,激光共聚焦显微镜观察表明,该启动子驱动的基因正常表达和并定位于细胞质中。克隆获得到了cab2基因的启动子,该启动子能够驱动番茄原系统素和GFP的融合蛋白正常表达和定位。

子宫内膜异位症恶变组织中RASSF2A启动子甲基化的表达差异性检测及其临床意义

目的通过运用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测子宫内膜异位囊肿(EC)组织、子宫内膜异位相关的卵巢癌(EAOC)中RASSF2A基因启动子甲基化(以下简称甲基化)的情况。探讨该基因启动子甲基化在子宫内膜异位恶变组织中的表达及临床意义。方法选取在宁波市妇女儿童医院进行手术治疗患者的石蜡包埋标本。30份正常子宫内膜组织,30份EC组织,30例卵巢透明细胞癌(OCC)组织,30份卵巢子宫内膜样腺癌(OEA)组织,比较甲基化在不同组织类型患者中的表达差异。显微镜观察筛选20份EAOC样本,比较甲基化与各种临床病理特征的关系。结果 OCC组织中RASSF2A启动子甲基化阳性率明显高于EC和正常子宫内膜组织(均P <0.05),OEA组织中RASSF2A启动子甲基化阳性率明显高于EC组织和正常子宫内膜组织(均P<0.05),EC组织中RASSF2A启动子甲基化阳性率高于正常子宫内膜组织(P<0.05)。EAOC组织中RASSF2A基因启动子甲基化率与患者年龄、临床分期、组织学分级及临床病理类型无关(均P> 0.05);RASSF2A基因启动子甲基化程度与淋巴结转移有关(P <0.05)。结论 RASSF2A基因启动子甲基化与子宫内膜异位症恶变存在联系。

果实特异性RNAi介导的Lcy基因沉默来增加番茄中番茄红素的含量

根据GenBank中番茄的番茄红素β-环化酶(Lcy)基因序列和八氢番茄红素去饱和酶基因(Pds)启动子序列设计特异引物从番茄基因组DNA中分别扩增出了Lcy基因的高度保守的长302bp的DNA片段和长1790的Pds启动子片段。根据RNAi的原理,将Lcy基因的DNA片段以正反两个方向通过一段内含子序列连接在一起形成RNAi片段,将该片段与Pds启动子一起插入到pVCT2020的表达载体中,通过农杆菌介导的方法转化番茄,获得转基因植株5棵,PCR检测证实外源片段已成功导入番茄基因组中。收获转色期后20d左右的完全成熟的番茄果实提取番茄红素进行含量分析,结果显示转基因番茄果实中番茄红素的含量极大的增加了。上述结果表明通过RNAi果实特异性的抑制类胡萝卜素代谢途径中生物合成酶基因的表达能够极大的增加番茄果实中番茄红素的含量。这为通过基因工程手段提高番茄果实中的营养价值提供了参考。

西瓜果实特异性基因wml1的5’端上游调控序列的分离

西瓜(Citrullus vulgris Schrad.)ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因wml1的表达具有果实特异性。本文利用Uneven PCR技术成功地从西瓜基因组DNA中分离出一段长1864bp、位于wml1基因5’端上游的新序列。该序列含有TATA盒和CAAT盒,具典型的启动子特征。克隆序列中180bp-1752bp和958bp-1752bp两个片段分别与GUS基因融合进行瞬间表达试验,结果初步表明180bp-1752bp片段具有果实特异性启动子活性,转录调控元件位于序列的180bp-958bp。

小麦高分子量谷蛋白1Dx2基因启动子的克隆及功能鉴定

以小偃6号基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应扩增到1kb左右的核酸序列,将其克隆到pMD18-T载体上。经测序鉴定及序列分析后得知,该片段为小麦高分子量谷蛋白基因(HMW-GS1Dx2)上游启动子及信号肽编码区,共1050bp。将其与β-葡糖苷酸酶(GUS)基因编码序列融合,用基因枪法将构建的嵌合基因转入小麦未成熟种子及叶片,检测其瞬时表达活性。组织化学检测表明,由该启动子驱动的GUS融合基因能在种子中表达,而在叶片中却未见表达,从而证实此HMW-GS1Dx2启动子具有在小麦胚乳中高效表达的活性,为小麦胚乳生物反应器的研究奠定了基础。

乳腺癌组织中C-erbB2基因启动子区CpG岛甲基化分析

目的了解乳腺癌组织中致癌基因C-erbB2启动子区CpG岛的甲基化状态。方法收集经病理确诊的39例乳腺癌患者甲醛固定的癌组织及相应的癌旁组织各39份;采用甲基化特异聚合酶链反应(MSP)检测C-erbB2基因启动子区CpG岛的甲基化状态。结果乳腺癌组织中C-erbB2基因启动子区CpG岛的甲基化率(51.3%)低于癌旁组织中存在的甲基化率(74.4%),二者之间差异有统计学意义(P<0.05)。结论所检测标本显示乳腺癌组织与癌旁组织间C-erbB2基因启动子区CpG岛甲基化率差异有统计学意义,提示C-erbB2的低甲基化可能是C-erbB2蛋白高表达和乳腺癌发生的原因之一。

八氢番茄红素合成酶(PSY2)基因果实特异表达载体的构建

八氢番茄红素合成酶是番茄红素合成的关键酶,通过PCR法获取PSY2基因和E8启动子序列,将目的基因和E8启动子序列构建到植物表达载体pBI101.2中,构建了果实特异表达启动子的八氢番茄红素合成酶基因植物表达载体。并采用PCR、限制性内切酶酶切和序列测定分析法,对重组质粒进行鉴定。结果表明,番茄果实特异性表达PSY2蛋白的重组质粒构建成功;通过农杆菌直接转化技术将其成功转入转化农杆菌LBA4404、EHA105,为下一步PSY2蛋白在番茄果实中特异表达奠定了基础。