PMA-qPCR方法快速检测细菌性果斑病菌活菌的研究

本文将叠氮溴化丙锭(PMA)与qPCR技术相结合,建立了一种适于细菌性果斑病菌株活细胞快速检测的PMA-qPCR方法。通过试验控制单因素变化,对PMA预处理反应体系中的各参数进行优化,确立了PMA终浓度为9μg·mL^(-1),曝光时间为8 min的PMA预处理体系,能有效抑制1.0×10^(7)mL^(-1)灭活死菌的扩增,对活菌的扩增没有影响。当活菌数在2.0×10^(1)~2.0×10^(6)mL^(-1),qPCR反应体系中活菌数与Ct值呈线性相关(R^(2)=0.9827)。本文建立的PMA-qPCR方法可在一定范围内有效去除细菌性果斑病死菌的干扰,定量检测出活菌数量,研究结果可为植物细菌性果斑病的流行规律研究提供新的技术支撑,并能有效避免PCR检测实际样品可能造成的假阳性结果。

63种杀菌剂对西瓜、甜瓜细菌性果斑病菌的室内毒力测定

由燕麦噬酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli,简称Aac)引起的西瓜、甜瓜细菌性果斑病(Bacterial Fruit Blotch,简称BFB)是西瓜、甜瓜生产上的一种毁灭性病害。目前资料上报道的一些药剂对果斑病菌的防效不尽一致,为明确这些药剂的防治效果及筛选更有效的药剂,试验采用抑菌圈法测定了63种杀菌剂对西瓜、甜瓜细菌性果斑病菌的室内毒力作用。结果表明:72%农用硫酸链霉素SPX等11种药剂对西瓜、甜瓜细菌性果斑病菌具有较好的抑制效果,抑菌圈平均直径>10.0mm;不同厂家生产的农用链霉素在相同浓度下抑菌效果明显不同;西瓜菌株和甜瓜菌株对同一药剂的敏感性也有较大差异。

免疫凝聚试纸条和TaqMan探针实时荧光PCR检测西瓜细菌性果斑病菌比较研究

以西瓜细菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp．citrulli）菌悬液和田间采集的病组织为试材，研究了免疫凝聚试纸条和实时荧光PCR技术检测的灵敏度和适应性。结果表明，免疫凝聚试纸条检测灵敏度为10^6 cfu／mL，具有简便、快速、易操作特点，适用于田间快速检测和病害诊断；TaqMan探针实时荧光PCR检测灵敏度达10^3～4 cfu／mL，比传统PCR检测灵敏度（10^5 cfu／mL）提高了10～100倍，且不需要琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色和Southern杂交。但需要昂贵的仪器和试剂，适用于室内检测及相关研究。

瓜类细菌性果斑病菌tvrR基因的克隆及其对致病性的影响

根据丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)DC3000中新的毒性基因tvrR(TetR-like viru-lence regulator)的氨基酸序列,从瓜类细菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli,Aac)的全基因组中发现并克隆了tvrR基因的同源物。通过同源重组的方法,构建了tvrR基因的插入突变体,并且经过PCR及Southern杂交验证确认。突变体和野生型一样可以激发烟草过敏反应。致病性试验结果显示:突变体比野生型的病程延长,但最终致病情况与野生型无差异。接种的寄主组织中菌体生长能力检测发现,突变体的繁殖速度慢于野生型,但最终其菌体数量也能达到野生型菌株的最大值。在营养丰富的LB培养基和营养贫乏的MMX基本培养基中生长测定均发现,突变体生长速度慢于野生型,但最终也能达到野生型的最大生长量。瓜类细菌性果斑病菌tvrR基因突变体致病性的改变与其生长能力变化的一致性表明,其致病性的变化是由于其生长能力的改变引起的。

西瓜细菌性果斑病菌Taq Man探针实时荧光PCR检测鉴定方法的建立

根据西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax avenaesubsp.citrulli)与相关细菌16S rDNA序列差异,设计出对西瓜细菌性果斑病菌具有稳定点突变特异性探针Aac-probe,利用该探针对23种供试菌株进行了实时荧光PCR检测实验。结果表明,只有西瓜细菌性果斑病菌能检测到荧光增强信号,其它细菌无荧光增强信号。该方法特异性强,灵敏度高,重复性好,可有效地应用于西瓜细菌性果斑病菌的检测。

利用PCR技术专化性检测瓜类细菌性果斑病菌

将hrpB2基因作为检测靶标,根据hrpB2基因设计了1对特异性引物HB2F2/HB2R2,用此特异引物从瓜类细菌性果斑病菌菌株中扩增出290 bp的特异性片段,而其余参试菌株和甜瓜组织的PCR反应结果为阴性,灵敏度试验证明可以检测到103CFU/ml靶标菌体。对市售的17个品种的甜瓜种子进行PCR检测,其中4个品种检测出携带有瓜类细菌性果斑病菌。将hrp基因作为靶标,为快速检测瓜类细菌性果斑病菌提供了新的方法。

抗瓜类细菌性果斑病菌单克隆抗体的制备及特性鉴定

以瓜类细菌性果斑病菌燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli,Aac)野生型菌株SD01免疫BALB/c小鼠,间接酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法筛选获得4株稳定分泌抗SD01菌株的单克隆杂交瘤细胞株6F、6D、7E、4F,腹水抗体效价分别为1∶102 400、1∶102 400、1∶25 600、1∶51 200。采用饱和硫酸铵沉淀及Protein-G亲和层析法纯化腹水,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)显示纯化后的单克隆抗体(m Ab)纯度较高,纯化后单克隆抗体(2 mg/m L)效价分别为1∶12 800、1∶6 400、1∶3 200、1∶6 400,亚型鉴定结果表明4种单克隆抗体均为Ig G2 a。间接ELISA结果表明,4种单克隆抗体对8种果斑病菌结合能力不同:6F可以结合6种,6D、4F可以结合8种,7E可以结合5种。与3种非Aac近源种植物病原菌交叉反应情况为:6F、4F与2种非Aac近源种植物病原菌存在交叉反应,6D、7E与3种非Aac近源种植物病原菌均无交叉反应。

广西西瓜、甜瓜细菌性果斑病菌检测及药剂毒力测定

【目的】筛选出对细菌性果斑病菌具有较好抑制作用的药剂,利用细菌性果斑病菌PCR检测技术,预防病害通过带病种子种苗传播扩散,为广西西瓜甜瓜细菌性果斑病害综合防治提供技术支撑。【方法】采用PCR方法对样品进行检测,用抑菌圈法测定13种杀菌剂对广西甜瓜细菌性果斑病菌株(WM0922-3和XD0611-7)和西瓜细菌性果斑病菌株(XD0819-2)的抑制效果。【结果】2014-2017年,检测种子共计345份,其中葫芦种子203份,检出率为6.4%;南瓜种31份,检出率为9.68%;西瓜种子66份,检出率为4.55%;甜瓜种子45份,检出率为26.67%;送检西瓜嫁接苗65份,检出率为7.69%。检测田间疑似样品共计405份,其中西瓜样品187份,检出率为10.69%;厚皮甜瓜样品186份,检出率为6.99%;薄皮甜瓜样品32份,检出率为18.75%。1号杀菌剂对3个菌株的抑制效果均为最好,有效浓度中EC50均小于0.4×10^(-3)mg/L;其后依次为40%甲醛、72%农用硫酸链霉素可溶粉剂、80%乙蒜素乳油和64%杀毒矾可湿性粉剂,其中80%乙蒜素乳油和64%杀毒矾可湿性粉剂对XD0819-2的抑制效果优于WM0922-3和XD0611-7;硫酸链霉素和12%中生菌素母药对WM0922-3和XD0611-7具有较好抑制效果,但对XD0819-2无抑制作用。47%加瑞农可湿性粉剂、30%琥胶肥酸铜可湿性粉剂、20%吗胍·乙酸铜可湿性粉剂、46%氢氧化铜水分散粒剂、20%噻菌铜悬浮剂和2%春雷霉素水剂对3个菌株均无抑制作用。【结论】广西市售的西瓜甜瓜种子、种苗和田间样品均检测到细菌性果斑病菌,因此,应加强西瓜甜瓜种子种苗检疫管理,杜绝带病种子种苗传播病害。在生产中,建议使用1号杀菌剂和40%甲醛药剂进行种子消毒处理。

免疫检测试纸条法检测西瓜子中的瓜类果斑病菌

将西瓜子进行表面消毒后破碎,用无菌水于4℃浸泡4h,取300μL浸提液加入250mL细菌液体培养基中,28℃150r/min培养3d,取培养液0.7mL与Agdia公司提供的瓜类果斑病菌检测试纸条样品浸提网袋中的缓冲液混匀,取混合液1mL用于免疫检测试纸条检测。该方法可有效检测出西瓜子中是否带有瓜类果斑病菌(Acidovorax avenaesub sp.citrulli(Schaadet al.)Willems et al.)。

瓜类果斑病菌的检测与防治进展

瓜类果斑病菌可引起西瓜、甜瓜等葫芦科植物患病,可通过种子远距离传播,是一种常见的瓜类采后果实腐烂的病原菌。该病害具有发病迅速、传播速度快等特点,一旦感染会对瓜类产量带来巨大损失,因而田间病菌的检测与诊断及早期预防十分重要。本文系统地综述了国内外瓜类果斑病菌的免疫学检测方法、分子生物学检测方法及防治等研究进展。

西瓜果斑病菌T2SS分泌蛋白的筛选和功能预测

利用KEGG和STRING数据库分析比较瓜类果斑病菌(西瓜嗜酸菌)(Acidovorax citrulli,Ac)和主要植物病原细菌Ⅱ型分泌系统(T2SS)的基因组成,收集有试验证据的植物病原细菌T2SS分泌蛋白序列信息,与已测序并经注释的果斑病菌AAC00-1菌株基因组进行序列比对,筛选出候选的果斑病菌同源T2SS分泌蛋白。通过对筛选出的分泌蛋白的信号肽、代谢通路、蛋白互作网络及其在植物细胞中的定位进行分析,预测部分分泌蛋白的生物学功能。

基于环介导等温扩增技术检测瓜类细菌性果斑病菌

本文利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),针对西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)基因组中Aave_4063和Aave_4064序列设计了2对特异引物Ac-F3/Ac-B3和Ac-FIP/Ac-BIP,建立了西瓜嗜酸菌的LAMP检测体系。利用该体系在65℃保温1h,通过荧光显色即可完成检测。设计的引物特异性强,其检测灵敏度为2.0×101 cfu/mL。该方法为西瓜嗜酸菌的检疫及其所致病害的快速诊断提供了新的技术。

细菌性果斑病菌Acidovorax avenae subsp.citrulli对黄瓜侵染及离体叶片接种方法的研究

由Acidovorax avenaesubsp.citrulli引起的细菌性果斑病对西瓜、甜瓜等葫芦科作物是一种毁灭性病害。对分离自发病甜瓜的细菌性果斑病菌供试菌株FC440的抗生素抗性特点、对黄瓜(Cucumis sativus L.)的致病性以及黄瓜离体叶片接种发病条件等病原生物学特性作了研究。结果表明:FC440对氨苄青霉素,氯霉素,壮观霉素,利福平和潮霉素具有抗性,对卡那霉素和四环素敏感,可侵染重要的经济作物黄瓜。离体叶片接种实验显示,不同缓冲液制备的菌悬液在供试黄瓜叶片上形成病斑存在差异,磷酸盐缓冲液(5和10 mmoL/L PBS)悬浮菌液发病较水悬浮菌液快,104cfu PBS悬浮菌的接种量和107cfu水悬浮菌的接种量分别可致黄瓜离体叶片在接种8 d内形成典型症状;病斑在划伤条件下以及在老龄叶片上形成快;以5 mmoL/L PBS(pH 7.4)悬浮,106cfu的接菌量划伤接种第一、二真叶期叶片,是离体黄瓜叶片上形成病斑的较好的接种方法。这些研究结果为利用该菌的抗生素抗性特点开展其遗传转化工作、离体接种以便规模筛选致病突变体以及研究其与寄主植物互作机制等方面的工作奠定了基础。

瓜类细菌性果斑病菌突变体文库的构建及群体感应信号分子突变株的筛选

利用三亲杂交的方法将带卡那抗性的Mini-Tn5转座子随机插入瓜类细菌性果斑病菌xjl12基因组DNA中,构建插入不同位点的突变体文库,通过信号分子高效检测菌株JZAI,筛选群体感应信号分子失活突变株。挑取2株野生株和筛选出的4株突变株,进行Southern杂交,结果表明,转座子Mini-Tn5以单拷贝随机诱变瓜类细菌性果斑病菌获得成功;对筛出的4株突变株进行了致病性和烟草过敏反应测试,发现突变株明显降低了致病性,且2株突变株(5-17,2-57)在烟草上无过敏反应。瓜类细菌性果斑病菌突变体文库的成功构建及筛选到不同突变位点的群体感应信号分子失活突变株,对从基因水平研究瓜类细菌性果斑病菌致病分子机理及群体感应相关基因奠定了基础。

瓜类果斑病菌致病基因及靶标基因的预测

哈密瓜果斑病是严重危害瓜类的种传细菌性病害,其病原菌为嗜酸菌属西瓜种(Acidovorax citrulli)。本文首先用Bioedit软件建立瓜类果斑病菌全氨基酸序列本地资源库,运用比较基因组学的方法,通过大量查找嗜酸菌属、欧文氏菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属、劳尔氏菌属、土壤杆菌属、木质部小菌属中的致病基因和参考文献中已报道的致病基因,下载相关致病基因的氨基酸序列,与瓜类果斑病菌的全氨基酸序列进行localblast,取E<10-5的为候选基因,得到果斑病菌中与致病性相关的基因,并对未知蛋白进行产物预测。同时,根据已经公布的靶标基因,用同样的比对方法,得到果斑病菌中潜在的靶标基因。本研究通过保守估计,得到77个致病性相关蛋白,预测了其中7个未知蛋白的产物,得到46个靶标蛋白。致病基因和靶标基因的分析预测,对以后研究此类基因提供了指导作用,为更好地防治该病害提供了理论基础。

黄瓜子叶细菌性果斑病菌侵染初期cDNA文库的构建及质量评价

【目的】构建黄瓜子叶细菌性果斑病菌侵染初期的cDNA文库,研究细菌性果斑病菌与黄瓜相互作用的分子机制奠定基础。【方法】以接种细菌性果斑病菌4d的Chineselong品种自交系9930黄瓜子叶为材料,分离纯化mRNA,反转录合成双链cDNA,利用同源重组的方法将双链cDNA转移到酵母双杂交载体pGADT7中,获得cDNA文库,对该文库质量进行分析。【结果】提取的黄瓜子叶总RNA电泳检测出3条特异性条带,分离纯化的mRNA电泳检测呈弥散条带;反转录合成的双链cDNA电泳条带呈弥散状均匀分布,大小分布在850~4000bp;黄瓜子叶cDNA文库的库容量达2.2×10 6CFU/mL,文库重组率为95.8%,文库插入片段的平均长度在1.5kb左右,达到了标准cDNA文库的要求。【结论】所获得的文库质量较高,可以用于进行与功能蛋白相互作用的筛选及研究细菌性果斑病菌与黄瓜相互作用的分子机制。

西瓜细菌性果斑病菌的室内药剂筛选试验

采用含毒介质法进行 6种杀菌剂对西瓜细菌性果斑病的室内毒力测定 ,结果表明 :链霉素、可杀得抑菌效果较好 ,抑菌最低有效浓度分别为 15 μg/mL和 15 0 μg/mL ;其次是细菌灵、细菌杀 ,抑菌有效浓度均为 30 0 μg/mL ,而叶青双、百菌清效果较差 ,抑菌最低有效浓度高达 60 0 μg/mL。

西瓜细菌性果斑病菌检测技术研究进展

西瓜细菌性果斑病菌能引起西瓜果斑病和哈密瓜果斑病等,由于病菌危害果实而成为一种毁灭性病害,常给生产带来严重损失。对于该细菌病害,较为可行的控制措施是实行检疫控制其扩展,而这有赖于准确、快速、灵敏的检测技术的应用。该文章较为系统地综述了国内外西瓜细菌性果斑病菌的分布与危害、生物学特性及检测方法等方面的研究进展。

瓜类细菌性果斑病菌对硫酸铜的敏感性检测与分析

果斑病菌两个亚群的143个菌株继代培养10代后,通过平板画线法对各菌株的硫酸铜敏感性检测结果表明：在硫酸铜浓度为300μg/mL（1.88 mmol/L）时只有一株菌株表现敏感,在浓度达到750 μg/mL（4.69 mmol/L）时所有菌株均表现敏感;浓度为450～650μg/mL （2.81～4.06 mmol/L）时分离自甜瓜的敏感菌株所占比率显著低于西瓜菌株;继代培养后所有菌株的硫酸铜敏感性没有改变,证实果斑病菌具有稳定的抗铜性.

瓜类果斑病菌荧光免疫层析试纸条的研制

为建立检测果斑病菌的新型免疫学检测技术,以异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)作为荧光探针,共价偶联抗瓜类果斑病菌野生型菌株SD01的鼠源单克隆抗体4F,将抗SD01单克隆抗体6D和羊抗鼠二抗喷涂于硝酸纤维素膜(NC膜)上分别作为检测线和质控线;以双抗体夹心反应模式制备检测果斑病菌的荧光免疫层析试纸条,并对试纸条的灵敏度、特异性及对实际样品的检测性能进行评估。结果表明:制备的荧光试纸条对纯培养果斑病菌SD01的检出限为3.1×10^(6)CFU∕mL;试纸条可检出8种果斑病菌(其中标准株1种,野生株7种),与6株近源的植物病原菌均无交叉反应,表明试纸条具有较高的特异性。在检测实际样品时,8种葫芦科植物的果斑病菌检出限为3.1×10^(6)CFU∕mL,表明汁液中的杂质对试纸条的检测灵敏度无影响,该试纸条适用于实际样品的检测。本研究制备的荧光试纸条操作简便、快速,结果肉眼可见,为果斑病菌的快速检测提供了一种新方法。