中国主要油茶产区山茶炭疽菌群体遗传结构分析

以中国主要油茶产区的油茶(Camellia oleifera Abel.)炭疽病优势种山茶炭疽菌(Colletotrichum camelliae)的16个地理种群168个菌株为供试材料,应用ISSR分子标记技术进行遗传多样性和种群遗传结构分析。16个地理种群的多态位点百分比(PPB)为98.99%,Nei’s基因多样性指数(He)为0.28,Shannon信息多样性指数(Is)为0.43,遗传相似度(I)平均为0.834,遗传距离(D)平均为0.183,表明山茶炭疽菌遗传多样性水平较高且异质性较强,种群间存在一定程度的遗传变异,遗传距离与地理距离之间无相关性。湖北省、浙江省、江西省、湖南省和广西5个省级种群总基因多样度(Ht)为0.274 8,遗传分化系数(Gst)为0.517 4,基因流(Nm)为0.466 4,表明山茶炭疽菌5个省级种群虽然被分化,但是不存在基因流动现象(Nm<1)。

草莓果生炭疽菌LysM效应子CfLysM2的致病功能分析

果生炭疽菌Colletotrichum fructicola侵染引起的草莓炭疽病是草莓生产中的重要病害。前期研究发现一个在果生炭疽菌侵染阶段高表达的含LysM结构域的候选效应子CfLysM2。为进一步研究CfLysM2的致病功能,运用同源重组方法构建CfLysM2缺失突变株ΔCfLysM2和回补菌株CfLysM2c。致病力测定结果表明,接种后15 d,ΔCfLysM2接种的草莓叶片病情指数显著下降。荧光定量PCR分析表明CfLysM2基因在果生炭疽菌接种草莓叶片后24 h相对表达量最高。利用转录组技术对野生型菌株(wild-type strain,WT)和ΔCfLysM2接种后24 h的草莓叶片样品进行比较分析,获得差异表达基因109个。CfLysM2的缺失导致宿主代谢途径尤其是次生代谢物生物合成通路的激活,说明CfLysM2可能在果生炭疽菌侵染草莓过程中通过靶向黄酮醇合成酶等代谢相关基因,抑制植物次生代谢产物合成及其介导的抗真菌免疫,保证其顺利侵染。该研究为揭示CfLysM2机理及对果生炭疽菌和草莓互作研究奠定了理论基础。

茶树炭疽菌CfSOM1基因的鉴定与生物信息学分析

Som1是cAMP-PKA信号途径下游的一个转录因子,在病原真菌发育和致病过程中可能发挥重要作用。为探究茶树炭疽菌SOM1基因的潜在功能,通过生物信息学方法在茶树炭疽菌N425基因组中鉴定SOM1同源基因,并对其编码蛋白的亲缘关系、理化性质、功能域和互作蛋白等进行分析。结果显示:在茶树炭疽菌N425基因组中鉴定得到一个SOM1同源基因CfSOM1,其编码蛋白CfSom1共含839个氨基酸,包括1个HTH二级结构、1个LisH结构域和2个NLS序列;CfSom1与炭疽菌属中的同源蛋白亲缘关系最近,与酵母菌中同源蛋白的亲缘关系最远;CfSom1被预测与6个核孔蛋白、c AMP依赖蛋白激酶催化亚基CpkA、拓扑异构酶II关联蛋白Ldb1、含WD结构域蛋白Swd1、Uba ts-n结构域蛋白Swa2、转录因子StuA和Cdtf1存在互作关系。这些研究成果将为后续展开对CfSOM1在茶树炭疽菌侵染茶树过程中的功能研究奠定基础。

果生炭疽菌Rab蛋白家族鉴定及生物信息学分析

利用已报道的酿酒酵母的11个Rab蛋白氨基酸序列及Rab数据库对果生炭疽菌全基因组数据进行比对分析,共获得果生炭疽菌Rab蛋白10个。生物信息学分析表明:这10个Rab蛋白均不含信号肽和跨膜结构域,均为亲水蛋白。CfRab1和CfRab7蛋白定位于质膜,CfRab4蛋白定位于线粒体,其余7个Rab蛋白定位于高尔基体。该Rab蛋白家族均具有保守结构域,在丝状真菌中高度保守。实时荧光定量PCR结果表明,相对于菌丝阶段,CfRab5A和CfRabX1在孢子发育阶段表达量最高,CfRab1、CfRab2、CfRab4、CfRab5B、CfRab6、CfRab7和CfRab8在果生炭疽菌侵染后48 h表达量最高。研究为探究草莓果生炭疽菌Rab家族成员的功能奠定了基础。

中国南方主要梨产区果生炭疽菌对苯醚甲环唑的敏感性

为明确苯醚甲环唑对果生炭疽菌Colletotrichum fructicola不同发育阶段的毒力,并建立中国南方主要梨产区(湖北、安徽、江西、江苏、浙江和福建)果生炭疽菌对苯醚甲环唑的敏感基线,采用孢子萌发法测定了苯醚甲环唑对6个代表性菌株孢子萌发和芽管伸长的影响,采用离体叶片接种法评价了苯醚甲环唑对该病菌的防治效果,采用菌丝生长速率法测定了120株果生炭疽菌对苯醚甲环唑的敏感性。结果表明:苯醚甲环唑对果生炭疽菌菌丝生长和芽管伸长的抑制效果较强,而对分生孢子萌发的抑制效果较弱,其平均EC50值分别为(0.33±0.03)、(2.61±0.26)和(29.87±1.31)μg/mL。160μg/mL的苯醚甲环唑对梨果生炭疽病的保护作用和治疗作用防效分别为92%和79%,而1000μg/mL的多菌灵则分别为51%和23%。来源于中国南方主要梨产区的120株果生炭疽菌对苯醚甲环唑均表现为敏感,EC50值范围0.27~1.12μg/mL,敏感性频率分布呈连续单峰曲线,符合正偏态分布,其平均EC50值(0.59±0.02)μg/mL可以作为我国南方主要梨产区果生炭疽菌对苯醚甲环唑的敏感基线。本研究结果为监测梨果生炭疽菌对苯醚甲环唑的田间抗药性发展奠定了基础,并为梨产区应用该药剂防治炭疽病提供了依据。

导致南方梨早期落叶的果生炭疽菌致病力分化分析

【目的】明确我国南方梨产区造成早期落叶的果生炭疽菌(Colletotrichum fructicola)的致病力分化状况并建立其室内快速测定方法。【方法】以梨的枝条、叶片和果实为材料,采用不同方法造成伤口后接种果生炭疽菌的强致病力菌株PAFQ32,通过比较各处理的测定效果筛选其室内快速测定方法,并对供试菌株的致病力进行观测和致病类型划分,分析不同菌株致病力分化与其地理来源之间的相关性。【结果】采用梨枝条、叶片和果实对果生炭疽菌致病力的观测结果显示,梨叶片经针刺后接种菌丝块的测定效果明显优于其他处理。供试菌株致病力的测定结果表明,来源于我国南方梨产区的111个果生炭疽菌菌株其致病力可划分为强、中、弱3个类型,其中强致病力菌株17个(15.3%);中等致病力菌株89个(80.2%);弱致病力菌株5个(4.5%)。不同地理来源的果生炭疽菌菌株,其致病类型的分布比例有异。【结论】果生炭疽菌的菌丝块针刺接种梨叶片的方法,可用于其致病力的室内快速测定。来源于我国南方梨产区导致早期落叶的果生炭疽菌存在明显的致病力分化,以中等致病力菌株为优势群体。

果生炭疽菌转录因子CfHac1的BRLZ结构域生物学功能研究

【目的】炭疽病是油茶的主要病害,导致巨大的经济损失。果生炭疽菌是油茶炭疽病优势致病菌。对果生炭疽菌的转录因子CfHac1的结构域进行分析,为进一步解析转录因子CfHac1调控病菌致病的分子机制奠定基础,对挖掘油茶炭疽病防控新途径具有重要的理论意义。【方法】采用点突变技术构建转录因子CfHac1结构域缺失载体,通过PEG介导法将该回补载体转化至CfHAC1基因完全缺失突变体的原生质体中,通过博来霉素抗性和荧光筛选获得结构域缺失回补菌株,进一步研究BRLZ结构域在果生炭疽菌中的生物学功能。【结果】结果发现转录因子CfHac1含有一个碱性亮氨酸拉链结构域(BRLZ),该结构域包含58个氨基酸残基;与野生型菌株和完全互补菌株相比,BRLZ结构域缺失突变株ΔCfhac1^(ΔBRLZ)生长速率显著降低,分生孢子产量显著减少,不能形成附着胞,对内质网压力胁迫更敏感,丧失对油茶叶的致病力,其表型与ΔCfhac1突变体一致。【结论】上述结果表明,BRLZ是转录因子CfHac1重要的结构域,对CfHac1在果生炭疽菌中行使正常的生物学功能具有重要的调控作用。

核桃炭疽病菌中GH互作蛋白找寻及遗传关系分析

【目的】植物病原真菌中的糖苷水解酶(GH)是参与破坏植物细胞壁的重要酶类,在真菌致病过程中发挥着重要作用。了解核桃炭疽病菌中GH蛋白的互作蛋白及其遗传关系,可为深入研究该病菌中GH家族蛋白的协同作用机制提供参考。【方法】基于前期所获得的胶孢炭疽菌Cg1中20个GH蛋白,通过STRING网络在线分析与其相似性较高的两个炭疽菌种——胶孢炭疽菌Cg-14和果生炭疽菌Nara gc5相关蛋白的互作关系;同时,利用生物信息学分析工具对这些蛋白进行了分子对接、亚细胞定位及遗传关系分析。【结果】两个炭疽菌菌株GH蛋白的互作情况极为相似。其中:GH5的互作蛋白数量最多,且GH5、GH6、GH7、GH11之间均存在明显互作关系;GH28亚家族中两个蛋白之间互作但不与其他GH亚家族蛋白互作;与单独GH蛋白存在互作关系的其他类蛋白多参与多糖催化、碳水化合物代谢等过程。不同蛋白之间均存在多个相互作用的氨基酸位点;仅GH72亚家族中的3个蛋白定位于质膜,其余蛋白均定位于细胞外;胶孢炭疽菌Cg1、Cg-14以及果生炭疽菌Nara gc5中GH蛋白明显分为四大类。其中:GH43亚家族中的3个蛋白分属于不同分支,亲缘关系较远;GH5中的3个蛋白有两个属于同一分支,另一个单独在一个分支;而GH7、GH11、GH28亚家族内部的蛋白均属于同一分支。【结论】核桃炭疽病菌中GH蛋白的互作关系主要有3种,即不同GH蛋白之间的互作、同一GH亚家族中不同蛋白之间的互作以及单独的GH蛋白。其中,大部分GH蛋白定位于细胞外,且大多数GH亚家族中不同蛋白之间的亲缘关系较近,仅有小部分亲缘关系较远。

根癌农杆菌介导的香蕉炭疽菌转化

利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化方法,以香蕉炭疽菌(Colletotrichum musae)的分生孢子为受体,pTHPR1为双元载体,成功实现了植物病原真菌香蕉炭疽菌的遗传转化.在诱导培养基pH 5.6、乙酰丁香酮200μg/mL、共培养时间24 h等适宜条件下,最高转化率可达260个转化子/106个孢子.对转化子的PCR检测表明,T-DNA已整合到香蕉炭疽菌的基因组中,转化子的遗传表现稳定.

希金斯炭疽菌14-3-3蛋白质生物信息学分析

希金斯炭疽菌(Colletotrichum higginsanum Sacc.)可以侵染菜心、萝卜等十字花科蔬菜引起炭疽病,不仅降低蔬菜的产量,还影响蔬菜的品质。基于酿酒酵母中2个典型14-3-3蛋白质序列,利用Blastp以及关键词对炭疽菌属蛋白质数据库进行搜索,明确该菌存在2个典型的14-3-3蛋白质,分别命名为ChFTT1、ChFTT2;对这两个蛋白质进行理化性质、二级结构、疏水性、信号肽、跨膜结构域以及亚细胞定位等生物信息学分析,可为深入研究希金斯炭疽菌14-3-3蛋白质功能提供参考。

希金斯炭疽菌PITP生物信息学分析

以酿酒酵母中已经报道的5个典型PITP序列为基础,对炭疽菌属蛋白质数据库进行Blastp比对以及关键词搜索,并通过SMART保守结构域分析,明确该菌含有4个典型的PITP;同时,通过对上述氨基酸序列进行疏水性、细胞信号肽、跨膜区结构域、亚细胞定位以及二级结构等生物信息学分析,并与其他物种中15个同源序列进行遗传关系比较分析,以期为深入开展希金斯炭疽菌(Colletotrichum higginsanum Sacc.)PITP的功能研究打下理论基础,同时,也为进一步开展其他炭疽菌的研究提供重要的理论指导。

希金斯炭疽菌腺苷酸环化酶生物信息学分析

希金斯炭疽菌(Colletotrichum higginsanum Sacc.)可以侵染菜心、萝卜等众多十字花科蔬菜引起炭疽病,给生产造成巨大的经济损失。通过对该菌中可能的腺苷酸环化酶(AC)氨基酸序列进行理化性质、细胞信号肽、跨膜区结构以及二级结构等生物信息学分析。结果表明,该菌种Ch Cap1,Ch Cap2与Srv2在理化性质、二级结构、亚细胞定位方面差异较大,以期为深入开展AC基因的定位、表达以及功能域等方面研究及为进一步实现以控制病原菌G蛋白信号途径功能新药物靶标的开发提供有力的理论支撑。

巴西橡胶树48份野生种质对胶孢炭疽菌抗性评价

选取来自巴西3个州的48份橡胶树(Hevea brasiliensis)野生种质,将胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)活化后进行大田接种鉴定及自然条件评价,以筛选抗性种质。橡胶树种质人工接种大田鉴定结果表明,抗病种质3份,中感种质14份,感病种质25份,高感种质6份;自然评价的结果与大田接种鉴定结果显著相关。3份抗性种质均来自于巴西Rondonia州。

铁皇冠炭疽病病原鉴定及室内药剂筛选

为明确引起广东省肇庆市高要区铁皇冠炭疽病的病原种类并筛选出具有较好防治效果的药剂,采用组织分离法对铁皇冠炭疽病病原菌进行了分离纯化;结合形态学观察、多基因系统发育分析及柯赫氏法则对该病原菌进行了分类鉴定。同时采用菌丝生长速率法,选用42.4%唑醚氟酰胺WG、75%肟菌·戊唑醇WG、35%400g/L氟菌·戊唑醇SC、325 g/L苯甲·嘧菌酯SC、60%唑醚·代森联WG、10%苯醚甲环唑WG对该炭疽菌的室内毒力进行测定。结果显示,引起铁皇冠炭疽病的病原菌为果生炭疽菌(Colletotrichum fructicola),供试的6种杀菌剂对C.fructicola的菌丝生长均有一定的抑制作用,其中10%苯醚甲环唑水分散粒剂的抑制活性最强,其次为325 g/L苯甲·嘧菌酯悬浮剂、75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂,以上3种杀菌剂均可推荐为田间防控药剂。

胶孢炭疽菌对核桃叶生理生化特性的影响

以离体的泡核桃(Juglans sigillata Dode)叶为材料,研究了胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)对核桃(Juglans regia L.)叶生理生化指标的影响。结果表明,接种胶孢炭疽菌感病后核桃叶片内超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性均随着感病时间的延长呈先升高后降低的趋势,过氧化物酶(POD)活性则随着感病时间的延长呈先下降后升高的趋势,核桃叶发病第三天和第五天的SOD、POD和CAT活性均显著高于对照;丙二醛(MDA)、可溶性蛋白质和可溶性糖含量均随着核桃叶感病时间的延长呈现出升高的趋势,其中,MDA含量在感病的第三天和第五天均显著高于对照,而可溶性蛋白质和可溶性糖含量与对照差异不显著;叶绿素含量随着核桃叶感病时间的延长而下降,在感病第五天叶绿素含量显著低于对照;感病核桃叶的净光合速率显著低于对照,气孔导度、胞间CO2浓度和蒸腾速率则与对照差异不显著。可见,胶孢炭疽菌感染对泡核桃叶片的生理生化特性有显著影响。

贵州百香果果实炭疽病病原菌分离及鉴定

炭疽病是贵州百香果果实重要病害之一。采用组织分离法,从贵州百香果炭疽病病果中分离到疑似炭疽菌株B10、ZB3,根据分离纯化菌株的形态特征、柯赫氏法则验证,以及基于ITS-TUB2-ACT-CHS-1多基因序列系统发育树分析,明确引起贵州产区百香果果实炭疽病病原主要为巴西炭疽菌Colletotrichum brasiliense和喀斯特炭疽菌C.karstii。

博落回叶片炭疽病病原菌的分离及分子鉴定

在福建省三明市明溪县博落回种植区发现疑似炭疽病病例,为明确福建三明地区博落回叶片炭疽病致病的病原菌,对采集的典型病样进行病原菌的分离,并采用形态学、分子生物学和致病性测定对病原进行鉴定。结果表明:从博落回病叶中共分离到20株菌株,所有菌株的菌落形态均一致,菌落圆形,白色,背面浅灰白色至肉桂色,分生孢子团橘红色,分生孢子为长椭圆形,单孢;ITS和TUB2基因系统发育树显示,供试的菌株和果生炭疽菌Colletotrichumfructicola均聚类在一起,置信度分别为82%和99%;致病性测定结果表明,发病叶片的症状与田间的一致,符合柯赫氏法则。通过病样发病症状、菌落形态及基因序列(ITS和TUB2)分析,发现引起三明市明溪县的博落回叶片炭疽病病原菌为果生炭疽菌C.fructicola。

一种引起板栗内腐病的果生炭疽菌鉴定及其生物学特性

板栗内腐病是板栗采后贮藏期主要病害,引起栗仁腐烂霉变,给生产带来巨大经济损失。为明确板栗内腐病的致病菌及其生物学特性,采用组织分离法获得菌株ZHZF21,通过形态学特征及ITS、TUB2、CAL多基因序列分析对该菌株进行鉴定,以菌丝块有伤接种法测定菌株ZHZF21的致病性,并对其生物学特性进行研究。结果表明,菌株ZHZF21的菌落呈墨绿色环状同心圆圈,具备有性和无性繁殖阶段。该菌株的序列与GenBank中编号为NDSTY31的果生炭疽菌(Colletotrichum fructicola)聚为一支。结合菌落形态特征及分子树将ZHZF21初步鉴定为果生炭疽菌。将菌株ZHZF21接种栗果后产生褐色病斑,与自然发病症状一致。该菌株在5~35℃均可生长,最适生长温度为25℃,致死温度为45~50℃,最适pH为6;在全黑暗条件下生长最快,阿拉伯树脂糖和酵母的利用率最高,乳糖的利用率最低,几乎不能利用尿素。

草莓属植物种质资源对炭疽病抗性的离体评价

【目的】对草莓属植物12个草莓野生种24份材料、1个栽培种41个品种、种间杂交种6个品种共71份种质资源的炭疽病抗性进行评价,为草莓属植物种质资源的利用提供依据。【方法】以从草莓上分离得到的果生炭疽菌(Colletotrichum fructicola)为接种病原,采用离体接种法将炭疽菌孢子悬浮液(1×10^6个分生孢子/mL)均匀接种在草莓叶片的叶面、叶柄上。置于28℃条件下保湿培养4 d,然后分别对每个叶片的发病情况进行调查,统计叶面病斑数量、叶面最大病斑直径、叶柄最大病斑长度。运用IBM SPSS 15.0软件对不同供试材料的叶面病斑数量、叶面病斑直径、叶柄病斑长度进行相关性分析。根据叶柄病斑长度对每个叶片的病害严重程度进行分级,计算每份材料的病情指数,以接种炭疽菌后叶柄的病情指数为依据对供试材料的炭疽病抗性进行评价。以草莓种类为固定因素,供试材料为随机因素,采用SAS中的一般线性模型程序计算凤梨草莓(41份)、东北草莓(3份)、绿色草莓(4份)、黄毛草莓(3份)、种间杂交种(6份)的病情指数差异(P<0.05)。【结果】供试材料中没有对炭疽病完全免疫的材料,所有材料在接种果生炭疽菌4 d后均有不同程度的发病。对不同材料间的对比发现,感染炭疽病后草莓叶柄病斑长度与叶面病斑数量、叶片病斑直径均呈极显著正相关。以接种炭疽菌后的叶柄病斑长度为依据可以对供试材料的炭疽病抗性进行区分,供试材料中高抗17份、抗病20份、中抗21份、中感3份、感病6份、高感4份,炭疽病抗性水平为中抗及以上的材料占全部供试材料的81.7%。凤梨草莓中的‘3公主’‘森加森加拉’‘达赛莱克特’‘全明星’‘香野’‘威斯塔尔’和‘京藏香’,种间杂交种中的‘桃薰’对炭疽病的抗性水平为高抗。在草莓野生种中全部东北草莓、绿色草莓、东方草莓供试材料对炭疽病的抗性水平为高抗,东北草莓和绿色草莓的病情指数显著低于凤梨草莓。【结论】对草莓属种质资源71份材料的炭疽病抗性进行了评价,从栽培草莓中筛选出‘3公主’‘森加森加拉’‘达赛莱克特’‘全明星’‘香野’‘威斯塔尔’‘京藏香’7个高抗品种。东北草莓和绿色草莓中存在高抗炭疽病的资源,其对炭疽病的整体抗性水平显著高于凤梨草莓,在种间杂交育种过程中可以作为炭疽病抗原来源。

湖北省草莓炭疽病菌对咪鲜胺的敏感性

由炭疽属真菌（ Colletotrichum spp.）引起的炭疽病是草莓育苗期的主要病害，在世界各地普遍发生。采用菌丝生长速率法，测定了湖北省内17个不同地区采集分离的103株草莓炭疽病菌株对咪鲜胺的敏感性。结果显示：咪鲜胺对湖北省草莓炭疽病菌的EC50值分布范围为0.0142~0.2156μg/mL，平均值为（0.0938±0.0299）μg/mL，其敏感性频率符合正态分布，因此可将该EC50平均值作为湖北省草莓炭疽病原菌群体对咪鲜胺敏感基线的参考值。