利用CODEHOP设计简并引物克隆镰刀菌果胶酶基因片段

利用CODEHOP(Consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers)设计真菌果胶酶基因片段的简并引物,并对设计的多对引物进行筛选,比较了普通PCR和Touchdown-PCR(TD-PCR)程序的扩增效果,并对产物进行了测序、比对和分析。结果表明:利用CODEHOP设计简并引物可信性强,阳性率高,能够从供试菌株中获得与目的片段大小相近的产物。利用TD-PCR程序扩增比普通PCR扩增效果好。扩增产物序列BLASTX比对和分析结果表明,产物片段编码的氨基酸序列与镰刀菌属来源的果胶酶氨基酸片段相似性均超过90%,说明所扩增的序列即为镰刀菌果胶酶基因片段。

果胶酶基因在内生芽孢杆菌中的过表达及其对定殖的影响

为探讨果胶酶基因与内生芽孢杆菌在植物体内定殖的相关性,PCR克隆了2株内生芽孢杆菌的果胶酶全长基因,并将全基因序列插入穿梭载体pGFP4412,构建了果胶酶基因过表达载体,转化内生细菌实现了果胶酶过表达.平板果胶酶酶活检测表明野生菌的水解圈直径仅为过表达突变体水解圈直径的50%.通过实时荧光定量PCR分析突变体和对照菌株(BS2-gfp和TB2-gfp)中果胶酶基因的表达情况,发现突变体的表达量分别是对照菌株表达量的82和85倍.统计了突变体与对照菌株28 d内在小白菜各组织中的定殖数量,结果表明:接种后1-3 d,突变体在根茎叶中的定殖数量与对照菌株比较,差异性显著(P<0.05).接种后7-28 d,除第7天(d 7)过表达菌株与对照菌株在根中的定殖菌量有显著性差异(P<0.05)外,其余统计结果均无显著性差异(P>0.05).在为期28 d的分离过程中,突变体的定殖数量经历了一个由显著高于对照菌株,到略高或逐渐与对照菌株的菌量趋于一致的过程.本研究初步证明了果胶酶基因在内生芽孢杆菌的定殖初期起到了一定的作用.

从富集液中发掘麻类脱胶果胶酶基因的技术

为了突破传统可培养技术筛选麻类脱胶用果胶酶基因的不足,通过设计不同总DNA提取方法、样品富集方法以及优化PCR反应体系,建立起了一套适合于直接从富集液中发掘麻类脱胶用果胶酶基因的技术。结果表明,震荡培养脱胶时间比静止培养脱胶时间缩短51.5%;通过PowerSoilTMDNA Isolation Kit从第4次富集后的震荡发酵中能提取适合的总DNA;PCR最优反应体系为:总体积为25 ml,Mg2+浓度为2.0 mmol/L,dNTPs浓度为0.2 ng/μl,引物浓度为0.6μmol/L,DNA模板取2.5 ng/μl,Taq聚合酶量为0.8 U。获得的基因序列与已报道的果胶酶基因FJ538208序列高度相似,应用该技术成功地从麻类脱胶富集液中克隆到了果胶酶基因。