大豆孢囊线虫果胶酸裂解酶基因Hg-pel-5的克隆与分析

【目的】克隆和分析与大豆孢囊线虫寄生密切相关的果胶酸裂解酶新基因,为研究大豆孢囊线虫寄生和致病的分子机理提供依据,并为探讨大豆孢囊线虫的防控新途径提供理论基础。【方法】通过EST分析结合RACE-PCR扩增方法,从大豆孢囊线虫中克隆出1个果胶酸裂解酶新基因;通过原位杂交和半定量PCR的方法确定基因的表达部位和分析不同发育阶段的基因表达;采用Southern杂交方法分析基因的拷贝数。【结果】从大豆孢囊线虫中克隆出1个全长为957个碱基编码227个氨基酸残基的新果胶酸裂解酶基因Hg-pel-5(GenBank登录号HQ123259)。Hg-pel-5基因组由2个外显子和1个内含子组成。预测蛋白含有20个氨基酸残基的信号肽和4段细菌结构的果胶酸裂解酶第三家族的保守位点。原位杂交确定Hg-pel-5在大豆孢囊线虫亚腹食道腺中表达。半定量RT-PCR结果表明Hg-pel-5在寄生前和寄生过程早期的2龄幼虫大量表达。Southern杂交结果显示Hg-pel-5存在于大豆孢囊线虫基因组中并以多拷贝形式存在。【结论】对大豆孢囊线虫中1个新的果胶酸裂解酶基因Hg-pel-5进行克隆和分析,表明该基因在大豆孢囊线虫早期寄生过程中发挥重要作用。

象耳豆根结线虫果胶酸裂解酶新基因Me-pel2的鉴定及发育表达分析

利用EST结合RACE方法从象耳豆根结线虫(Meloidogyne enterolobii)中克隆一个新的果胶酸裂解酶基因Me-pel2(Gen Bank登录号KP987180)。Me-pel2 c DNA开放阅读框全长834 bp,推导编码277个氨基酸残基的蛋白,属于多糖裂解酶第III家族新成员。Me-PEL2与南方根结线虫果胶酸裂解酶Mi-PEL3氨基酸具有较高的一致性,为54%。发育表达结果显示,Me-pel2在2龄幼虫和雄虫期高丰度表达,而在固着期寄生阶段转录水平急剧下降,推测Me-pel2主要在象耳豆根结线虫迁移性阶段起重要作用,通过降解寄主细胞壁果胶质成分,协助幼虫侵入寄主以及在寄主体内迁移。

产果胶酸裂解酶的耐盐碱性菌株分离及培养条件

从江苏省沿海滩涂国家丹顶鹤自然保护区盐碱土样中,分离得到一株果胶酸裂解酶产生菌ZQX8,经形态、生理生化特征和16SrDNA鉴定,初步鉴定为枯草芽孢杆菌.该株菌的最佳培养条件为37℃、pH6.5、0.1～0.25mol/LNaCl,但在pH7～9之间,0.5～1.0mol/LNaCl浓度下仍然能较好的生长,表现出一定的耐盐性和耐碱性.该菌分泌的胞外果胶酸裂解酶的最佳底物为果胶酸,在培养基中酶活达到4U/mL.该果胶酸裂解酶在40～60℃,pH8～10的碱性条件下酶活较高,在600mmol/LNaCl存在的条件下,也能保持较高的酶活,显示该酶具有一定的耐碱性和耐盐性.

番茄(Solanum lycopersicum)果胶酸裂解酶P56在大肠杆菌中的重组表达

果胶酸裂解酶P56在番茄花粉管伸长过程中起着重要的作用,为了制备番茄P56蛋白的抗体,进行番茄花粉管萌发过程中P56蛋白的免疫组织化学研究,对P56基因在大肠杆菌系统的重组表达进行了研究。先采用Overlap-PCR的方法,从番茄基因组DNA中克隆了成熟P56蛋白的cDNA序列(LAT56),再构建重组表达质粒pET28a(+)-LAT56,转化大肠杆菌BL21-CodenPlus(DE3)-RIL,得到了重组表达工程菌pET-28a(+)-LAT56-BL21-Co-denPlus(DE3)-RIL。在0.5 mmol/L IPTG、15℃和180 r/min条件下,经过60 h的诱导培养,重组蛋白表达量为细胞总蛋白的30%左右,主要以包涵体形式存在,重组蛋白经Ni2+-nitrilotriacetate-agrose亲和柱层析,得到了SDS-PAGE显示为单一蛋白带的纯化蛋白。

促进剂对发酵生产碱性果胶酸裂解酶的影响

为制取适用于纺织用碱性果胶酶,必须得到高酶活的发酵液.通过促进剂的单因素试验及正交试验,对BacillussubtilisWSH02-02产生碱性果胶酸裂解酶的摇瓶发酵条件进行了优化.优化后该菌株产酶活比对照提高了30%,所采用的促进剂优化组合为:Tween 603g/L,CaCO37g/L,MgSO4·7H2O4g/L.

克雷伯氏菌果胶酸裂解酶基因K-PGL的获取与序列分析

【目的】研究克雷伯氏菌果胶酸裂解酶基因K-PGL的序列特征及其编码产物的理化性质、结构特征及同源性等。【方法】根据同源序列相似性设计引物,利用PCR、染色体步移等技术获得了基因序列,并对基因信号肽,疏水性和结构域等进行了分析。【结果】获得克雷伯氏菌2395 bp序列,其中K-PGL基因开放阅读框1710 bp,编码569个氨基酸,分子质量63.37 kDa,等电点7.17。编码蛋白具有信号肽酶切割位点,效率为0.864,序列中不含有半胱氨酸Cys,平均疏水指数为-0.449,为稳定存在的亲水蛋白。基因编码的蛋白具有内切聚半乳糖醛酸裂解酶基因家族特有的保守结构域,进化上与产酸克雷伯氏菌亲缘关系最近。【结论】获得了K-PGL基因序列及其特征,为进一步研究果胶酸裂解酶的生物学功能和应用提供依据。

甘薯长喙壳菌果胶酸裂解酶基因克隆及生物信息学分析

由甘薯长喙壳菌(Ceratocystis fimbriata)引起的甘薯黑斑病是甘薯重要的病害之一,但其致病机制尚不明确.根据已有的甘薯长喙壳菌全基因组序列,以山东潍坊样品中分离到的菌株SD为模板,扩增病菌重要致病因子果胶酸裂解酶基因CfPL,并对蛋白分子质量、理论等电点、跨膜区、亲疏水性、磷酸化位点等理化性质进行分析.结果表明,CfPL基因开放阅读框长度为1551 bp,编码516个氨基酸,蛋白分子质量为52.5 kD,理论等电点为4.87,为稳定的亲水性蛋白.蛋白定位在细胞外,无跨膜结构和糖基化位点,含有92个磷酸化位点、1个信号肽,属于果胶裂解酶C类家族成员.对CfPL基因克隆及相关生物学特性的分析,可为进一步阐明其基因功能和病菌致病机理提供参考.

禾谷孢囊线虫果胶酸裂解酶新基因Ha-pel-1的鉴定与表达特征分析

【目的】禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)是一种严重危害麦类作物的重要植物病原线虫,对农业生产造成巨大的经济损失,然而其致病机制和有效防控方法还有待进一步研究。通过克隆禾谷孢囊线虫的果胶酸裂解酶新基因Ha-pel-1,并对其表达特性进行分析,为后续探究Ha-pel-1的基因功能及其与寄主的互作提供理论依据,并为探讨禾谷孢囊线虫防控途径提供新思路。【方法】采用同源克隆结合RACE技术从禾谷孢囊线虫中克隆出一个新的果胶酸裂解酶基因;采用DNAMAN、Clustal、Signal P 4.0 Server和GSDS等相关生物信息学软件和在线工具分析该基因的核苷酸和氨基酸序列,并使用MEGA 5.0构建系统进化树;采用原位杂交和半定量PCR方法确定该基因的在禾谷孢囊线虫中的表达部位及其在线虫不同龄期中的表达情况。【结果】从禾谷孢囊线虫中成功克隆出一个果胶酸裂解酶基因Ha-pel-1(Gen Bank登录号GQ998895),该基因c DNA全长1 717 bp,包含一个长度为1 563 bp的开放阅读框,编码一个长度为521个氨基酸残基的蛋白,其理论分子量为57.5 k D,理论等电点为8.52。从线虫基因组DNA中扩增获得长度为7 199 bp的Ha-pel-1基因组全长,基因结构显示分析发现,Ha-pel-1基因组包含14个外显子和13个内含子,除第3个内含子剪接位点是GC-AG外,其余12个内含子都符合真核生物基因剪接位点GT-AG规则。同源比对结果表明,预测蛋白Ha-PEL-1的C端与大豆孢囊线虫果胶酸裂解酶HG-PEL-1、甜菜孢囊线虫果胶酸裂解酶HS-PEL-1均有67%的一致性和83%的相似性;此外,其N端信号肽后比报道的其他植物寄生线虫果胶酸裂解酶多出一段长度为254个氨基酸残基的序列,这段序列中,靠近N端的184个氨基酸残基与数据库中的蛋白均无相似性,而靠近C端有70个氨基酸残基(Lys205—Glu274)与韦塞尔斯布朗病毒NS5蛋白(注册号3ELD)的甲基转移酶区域有32%的一致性和47%的相似性。氨基酸序列分析发现,预测蛋白Ha-PEL-1包含一个长度为20个氨基酸残基的信号肽和4个果胶酸裂解酶第3家族(PL3)的高度保守区域以及多个保守的半胱氨酸残基;系统进化分析发现,Ha-pel-1及其他已报道的线虫果胶酸裂解酶基因与细菌和真菌来源的PEL聚在一个大的分支中;原位杂交结果显示Ha-pel-1主要在禾谷孢囊线虫亚腹食道腺中表达;半定量RT-PCR确定Ha-pel-1在寄生前和寄生后的2龄幼虫中大量表达。【结论】通过对禾谷孢囊线虫中一个新果胶酸裂解酶基因Ha-pel-1的克隆和表达特征分析,揭示该基因与禾谷孢囊线虫的侵染和寄生过程密切相关。

离子注入结合紫外线及^(60)Co-γ射线诱变选育碱性果胶酸裂解酶高产菌株的研究

以碱性果胶酸裂解酶产生菌芽孢杆菌WZ008为出发菌株,经形态鉴定和16S鉴定为类芽孢杆菌,命名为Paenibacillus sp.WZ008,通过N^+注入诱变、紫外线诱变、^(60)Co-γ射线诱变等多次反复诱变,选育得到一株产碱性果胶酸裂解酶性能稳定且酶活明显提高的突变株,其酶活为97.8U/mL,比出发菌株产碱性果胶酸裂解酶能力提高了1.04倍。

宏基因组来源果胶酸裂解酶在毕赤酵母中的表达及应用

果胶酸裂解酶可用于含果胶废水的处理、纸浆漂白以及棉麻纺织品的生物精炼等。基于高通量宏基因组测序技术,从富含果胶土壤宏基因组中挖掘得到一个果胶酸裂解酶基因pela。将pela连接表达载体p PIC9转化毕赤酵母Pichia pastoris GS115。在3 L发酵罐水平,甲醇诱导10 h后,培养基中果胶酸裂解酶活力达到10.8 U/m L。重组PELA的最适温度为45℃,最适pH为9.0,在pH 7.5~11.0具有良好的稳定性。PELA的比活力为244.12 U/mg,以聚半乳糖醛酸为底物时催化反应的Km和Vmax分别为0.26 mg/m L和488.40μmol/min·mg。EDTA及金属离子Cd^(2+)、Zn^(2+)、Mn^(2+)、Cu^(2+)、Fe^(3+)能够高度抑制酶的活性,1 mmol/L Ca^(2+)和2 mmol/L K^+对酶活力有促进作用。将重组PELA作用于苎麻纤维4 h后,纤维质量损失率达到9.2%,苎麻纤维分散度和白度都明显提高。结果表明从宏基因组来源的果胶酸裂解酶PELA在苎麻脱胶中具有良好的应用潜力。

响应面法优化壳聚糖固定果胶酸裂解酶的研究

果胶酸裂解酶(PL,EC:4.2.2.2)广泛应用于果蔬汁澄清、纸浆漂白、苎麻脱胶等领域。本文以壳聚糖为载体,对多粘类芽孢杆菌来源的重组果胶酸裂解酶PpPel10a的固定化进行了探索。首先利用单因子试验考察壳聚糖浓度、戊二醛浓度、游离酶添加量、吸附时间和吸附温度对壳聚糖交联固定PpPel10a的影响,并通过响应面法进一步优化。结果表明当壳聚糖浓度3.5%,戊二醛浓度3%,游离酶添加量8 mg/g,吸附时间5 h,吸附温度30℃时酶活回收率最高,达到87.3%。与游离的PpPel10a相比,固定化PpPel10a对pH和高温均呈现出更好的耐受性。重复使用7次后,固定化PpPel10a的酶活力仍能保留30%以上。此外,利用固定化PpPel10a处理苎麻纤维,通过电子显微镜扫描发现,与对照相比酶处理获得的纤维表面更加平滑且纤维分散度较高。这说明固定化的PpPel10a在苎麻纤维脱胶中具有一定的应用潜力。

象耳豆根结线虫果胶酸裂解酶基因的克隆及其RNAi效应分析

从象耳豆根结线虫中首次克隆了果胶酸裂解酶基因Me-pel-1,该基因cDNA的开放阅读框(ORF)长813 bp,编码270个氨基酸,具有果胶酸裂解酶第3家族的4个保守域特征。ME-PEL-1与南方根结线虫的果胶酸裂解酶MI-PEL-1和爪哇根结线虫的果胶酸裂解酶MJ-PEL-1相似性最高,且系统进化树显示ME-PEL-1也与它们最为接近。利用RNAi技术对象耳豆根结线虫2龄幼虫的Me-pel-1进行沉默,结果发现Me-pel-1基因被干扰后,象耳豆根结线虫2龄幼虫对番茄的侵染率显著降低。该结果表明Me-pel-1基因在象耳豆根结线虫侵染寄主的过程中发挥重要作用。

米曲霉果胶酸酯裂解酶(pectin lyase 1)在原核系统中重组表达

来自米曲霉(Aspergillus oryzae)和黑曲霉(Aspergillus niger)的果胶酸酯裂解酶(pectinlyase)一直被用于传统发酵食品的生产,但自然条件下A.oryzae和A.niger的果胶酸酯裂解酶产量较低。通过RT-PCR的方法,获得不含信号肽的A.oryzaePel1cDNA,将Pel1cDNA连入pET-28a(+)载体,构建pET-28a(+)-pel1质粒。pET-28a(+)-pel1转化Turner(DE3)placⅠ细胞,得到转化子pET-28a(+)-pel1-Turner(DE3)placⅠ,表达与6个组氨酸融合的Pel1。进一步对Pel1在E.coli系统中表达的条件进行了研究,在37℃,220r/min条件下,培养pET-28a(+)-pel1-Turner(DE3)placⅠ细胞,当OD600至0.8左右时,用500μmol/Lisopropylβ-D-thiogalactogalactop-yranoside(IPTG)进行诱导表达,在15℃和170r/min条件下,继续培养60h后,表达效果最好,产酶可达到400u/mL,是A.oryzae自然条件下产酶量的4000倍,也高于已报道的真菌果胶酸酯裂解酶在真菌体系中重组表达的效果。

蜡样芽孢杆菌HDYM-02果胶质降解酶的诱导及亚麻脱胶应用

为了挖掘具有亚麻脱胶潜力的微生物资源并验证其在温水沤麻中的脱胶效果,本文首先考察了蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus) HDYM-02产果胶质降解酶的能力。结果表明,魔芋粉和果胶能显著诱导供试菌株产生两种果胶质降解酶,其中果胶裂解酶的活力最大值分别为(1 678. 33±3. 68)和(1 602. 67±14. 01) U·mL^(-1),果胶酸裂解酶的活力最大值分别为(670. 67±5. 31)和(488. 33±4. 92) U·mL^(-1)。进而构建加菌沤麻体系,沤麻液中的果胶裂解酶和果胶酸裂解酶的活力最大值分别为(721. 86±16. 02)和(213. 99±0. 70) U·mL^(-1),显著高于不加菌的自然对照组(P <0. 05)。同时,加菌组亚麻纤维失重率达到16%,亚麻原茎中的果胶和果胶酸利用率分别为(85. 88±0. 69)%和(63. 09±2. 16)%,均显著高于自然对照组(P <0. 05),比自然对照组分别提高了1. 12和1. 85倍。结果表明,供试菌株B. cereus HDYM-02可同时产生两种果胶质降解酶,这两种酶能高效去除亚麻胶质组分,在亚麻生物脱胶领域有广阔的应用前景。

番茄P56和部分来源多糖裂解酶家族Ⅰ的其它蛋白的系统演化分析

果胶裂解酶包含果胶酸裂解酶(pectate lyase)和果胶酸酯裂解酶(pectin lyase)二种形式,是一类多糖裂解酶,由细菌、真菌、植物和线虫等生物产生,分布在5个多糖裂解酶家族,果胶酶在食品与饮料、纺织与洗涤、制药等工业中有广泛的应用。利用NCBI BLASTX服务器,搜索与番茄P56蛋白氨基酸序列相似且都属于多糖裂解酶家族Ⅰ的果胶裂解酶蛋白序列共28条,用DNAMAN软件分析其保守区,用CLUSTALX8.0软件进行序列比对和Bi-oEdit软件进行文件转换,进一步用PUAP4.0软件构建系统进化树。构建的MP树(phylogenetic trees)和NJ树(neighbor-joining)显示:来自植物的果胶酸裂解酶、真菌的果胶酸酯裂解酶、细菌的果胶酸裂解酶分别可聚为一个独立的类群;相对于细菌果胶酸裂解酶和真菌果胶酸酯裂解酶而言,构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的果胶酸裂解酶A和植物的果胶酸裂解酶之间有较近的亲缘关系;细菌Pseudomonas syringae的果胶酸酯裂解酶和真菌的果胶酸酯裂解酶之间的亲缘关系较近。

欧文氏菌T85-166果胶酶基因克隆与序列分析

根据果胶酶Pel基因在欧文氏菌基因组上的分布特点,通过合理设计引物,从欧文氏菌株T85-166克隆出3个果胶酶Pel基因(Pel-1、Pel-2和Pel-3),它们分别编码372、373和374个氨基酸。序列分析表明,Pel-1前105及后100个氨基酸序列与Pel-2完全相同,但与Pel-3有较大差异,而中间170个左右的氨基酸序列与Pel-3则高度相似。初步构建了3个Pel基因的工程菌。

PelA-Expansin融合蛋白原核重组表达研究

扩张蛋白(Expansin)具有削弱细胞壁多糖之间氢键,增强多糖降解酶降解多糖的效率。在食品领域、生物能源领域和生物制药领域,具有广泛的应用价值。自然状态下,Expansin蛋白在植物、真菌、细菌等生物中的表达量较少,目前,枯草芽孢杆菌Expansin重组表达研究受到广泛关注。以来源于构巢曲霉的果胶酸裂解酶(PelA)为融合标签,构建高效表达融合蛋白PelA-Expansin的工程菌newexpansin/pelA-pET-28a(+)/BL21(DE3),在OD_(600)为0.4、0.01 mmol/L IPTG、15℃和150 r/min下,表达24 h,融合蛋白产量约为3.0 mg/mL。建立融合蛋白一次性His-tag亲和纯化工艺,工艺中上样、清洗和洗脱缓冲液中咪唑浓度分别为30、60和500 mmol/L,目标蛋白纯度约为95%,得率约为75%;融合蛋白协同纤维素酶、木聚糖酶和果胶酸水解酶酶降解多糖的效率分别为300%、150%和125%;为扩张蛋白Expansin在食品、能源、医药及农业等领域的应用奠定了基础。

Bioscouring Knitted Cotton Fabric with an Experimental Pectate Lyase

An experimental pectate lyase enzyme was used to scour knitted cotton fabric and the emphasis was on pectin removal.Using an enzyme dosage of 0.2 g/L at temperature 55℃ and pH 6.35 for 30 min,good scouring properties were obtained.When appropriate concentrations of 1-Hydroxy Ethylidene-1,1-Diphosphonic Acid(HEDP)and CaCl2 were added,the percentage pectin removal improved significantly.