舒肝和络醒脾方对四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠转化生长因子β/果蝇母本抗生存因子蛋白信号通路作用的研究

目的探讨舒肝和络醒脾方(SHXD)的抗肝纤维化(HF)作用。方法将60只SPF级Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、对照组和低、中、高剂量实验组,每组10只;除空白组外,其余组大鼠均腹腔注射40%四氯化碳构建HF大鼠模型。模型组灌胃给予与实验组等量的0.9%NaCl;对照组灌胃给予0.50 mg·kg^(-1)秋水仙碱溶液;低、中、高剂量实验组分别灌胃给予3.15,6.30和12.60 g·kg^(-1)(生药/体质量)SHXD。5组大鼠每天给药1次,连续8周。空白组不做任何处理,正常喂食喂水,作为对照观察使用。用实时荧光定量聚合酶链反应检测肝组织中转化生长因子β1(TGF-β1)和果蝇母本抗生存因子蛋白(Smad2)mRNA的表达水平,用酶联免疫吸附实验法检测血清中HF 4项含量。结果中、高剂量实验组和对照组、模型组、空白组的TGF-β1mRNA表达水平分别为1.36±0.19,1.40±0.12,1.53±0.14,1.58±0.13和1.00±0.00,Smad2 mRNA表达水平分别为1.17±0.06,1.24±0.09,1.52±0.14,1.42±0.13和1.00±0.00,层黏连蛋白的含量分别为(353.92±27.40),(309.46±22.57),(341.48±25.14),(436.71±39.51)和(205.89±27.00)ng·mL^(-1),透明质酸酶的含量分别为(117.50±9.80),(95.48±8.83),(123.24±11.02),(143.01±13.20)和(79.62±6.79)ng·mL^(-1),Ⅳ型胶原的含量分别为(60.93±6.02),(51.57±5.12),(68.91±7.35),(82.91±8.61)和(41.93±5.04)ng·mL^(-1),Ⅲ型前胶原分别为(1.85±0.33),(2.04±0.24),(2.11±0.30),(3.38±0.38)和(1.83±0.26)ng·mL^(-1)。中、高剂量实验组的上述指标与模型组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论SHXD具有一定的抗HF作用,以高、中剂量作用效果最为显著;TGF-β/Smad通路可能为其抗HF的信号途径之一。

除风益损汤对兔角膜损伤后瘢痕形成及TGF-β1、Smad3、α-SMA蛋白表达的影响

目的探讨除风益损汤对兔角膜损伤后瘢痕形成及转化生长因子-β1(ransforming growth factor-beta 1,TGF-β1)、果蝇母本抗生存因子蛋白3(small mothers against decapentaplegic 3,Smad3)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)蛋白表达的影响。方法取健康月龄新西兰兔48只,按随机数字法将其分成4组,每组12只,设为空白组、模型组、除风益损汤组(以下简称中药组)、重组牛碱成纤维细胞生长因子滴眼组(以下简称贝复舒组);中药组予除风益损汤灌胃,1次/d,空白组、模型组、贝复舒组予等体积生理盐水灌胃,1次/d,贝复舒组予重组牛碱成纤维细胞生长因子滴眼液滴眼,3次/d;建模后各组于7、14、28 d在高倍显微镜下观察角膜损伤修复情况,共聚焦激光断层扫描观察角膜细胞,Masson染色观察角膜组织病理改变,Western blot检测角膜组织中TGF-β1、Smad3、α-SMA蛋白表达。结果眼前节拍照:可见兔角膜7、14、28 d时中药组、贝复舒组角膜损面积伤较模型组角膜损伤面积明显减小。共聚焦激光断层扫描角膜浅层细胞:在造模后28 d,模型组呈现出大量瘢痕组织,同时存在肌成纤维细胞;中药组和贝复舒组可见成纤维细胞及角膜基质细胞,以及极少量瘢痕组织。角膜混浊度分级:与空白组比较,模型组在造模后7、14、28 d的角膜混浊分级均明显升高(P<0.01),呈时间相关性,但28 d时模型组的角膜混浊分级出现回落,与模型组相比,中药组和贝复舒组在造模后7、14、28 d的角膜混浊分级均明显降低(P<0.01),且呈时间相关性(P<0.01)。Masson切片染色:在造模后28 d,空白组可见角膜上皮整齐连续排列,基质层纤维排列整齐,染色致密,厚度均一;模型组伤口处角膜上皮细胞不连续分布,且角膜前部基质浅蓝色胶原纤维排列紊乱,呈不连续状态,厚度不一,角膜后部基质浅蓝色胶原纤维排列较混乱,呈紊乱纤维束;中药组可见角膜前部基质浅蓝色胶原纤维较模型组排列有序,稍疏松,呈连续状态,角膜后部基质浅蓝色胶原纤维排列有序;贝复舒组见角膜前部基质浅蓝色胶原纤维较模型组排列有序,稍疏松,呈连续状态,仍存在纤维束,角膜后部基质浅蓝色胶原纤维排列有序。Western blot检测:与模型组比较,中药组、贝复舒组的角膜组织中TGF-β1、Smad3、α-SMA蛋白表达在7、14、28 d时均显著降低(P<0.05)。结论除风益损汤能促进角膜损伤修复,抑制角膜瘢痕化,并对TGF-β1、Smad3、α-SMA蛋白产生影响。

肾气丸对肾间质纤维化大鼠肾组织TGF-β1/Smad3信号通路及AngⅡ表达的影响

目的探讨肾气丸对肾间质纤维化大鼠肾组织转化生长因子(TGF)-β1/果蝇抗生物皮肤生长因子蛋白家族(Smad)3信号及血管紧张素(Ang)Ⅱ表达的影响。方法SD大鼠分为正常组、模型组、实验组、过表达组,其中模型组、实验组、过表达组每日以250 mg/kg的腺嘌呤生理盐水混悬液进行灌胃处理造模,每日1次,连续12 d后,更换为每两日1次,连续12 d,造模周期共24 d,正常组以等剂量的生理盐水进行灌胃;实验组每日尾静脉注射5×10^(9) pfu/ml的pcDNA3.1-TGF-β1-NC,并且以10 g/kg的肾气丸进行灌胃处理;过表达组每日尾静脉注射5×10^(9) pfu/ml pc DNA3.1-TGF-β1,并且以10 g/kg的肾气丸进行灌胃处理;模型组和正常组每日尾静脉注射5×10^(9) pfu/ml的pcDNA3.1-TGF-β1-NC并以生理盐水进行灌胃处理。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组大鼠血清血肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)的含量,免疫组化检测各组α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅳ型胶原蛋白(ColⅣ)的表达,Western印迹法检测肾组织中AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3的表达水平。结果与正常组相比,模型组、实验组、过表达组血清中Scr和BUN的含量、α-SMA和ColⅣ的阳性细胞比例及AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3的表达明显升高(均P<0.05);与模型组相比,实验组、过表达组血清中Scr和BUN的含量、α-SMA和ColⅣ的阳性细胞比例及AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3的表达明显降低(均P<0.05);与实验组相比,过表达组血清中Scr和BUN的含量、α-SMA和ColⅣ的阳性细胞比例及AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3的表达明显升高(均P<0.05)。结论肾气丸能减轻肾间质纤维化大鼠肾组织的病理损伤,改善其肾功能,这与抑制TGF-β1/Smad3信号的激活有关。

妊娠期高血压疾病孕妇胎盘组织中HDAC8和SMAD4的表达及与妊娠结局的相关性

目的探讨妊娠期高血压疾病(HDCP)孕妇胎盘组织中组蛋白去乙酰化酶8(HDAC8)、果蝇母本抗生存因子蛋白同源物4(SMAD4)的表达与疾病严重程度及妊娠结局的相关性。方法选择2020年8月至2022年12月河北中石油中心医院收治的96例HDCP孕妇为观察对象(HDCP组),根据病情严重程度将其分为妊娠期高血压组35例,轻度子痫前期(PE)组33例,重度PE组28例;选择同期96例健康孕妇为对照组。根据妊娠结局,将HDCP孕妇分为妊娠结局良好组57例与妊娠结局不良组39例。以免疫组化法检测HDCP孕妇胎盘组织中HDAC8、SMAD4的表达水平,以实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测胎盘组织中HDAC8 mRNA、SMAD4 mRNA的表达水平;比较不同组别孕妇及不同妊娠结局孕妇胎盘组织中HDAC8、SMAD4的表达,以受试者工作特征(ROC)曲线分析HDAC8 mRNA、SMAD4 mRNA诊断HDCP孕妇发生不良妊娠结局的价值;采用多因素Logistic回归分析HDCP孕妇妊娠结局的影响因素。结果HDCP组与对照组胎盘组织中HDAC8、SMAD4的阳性表达率(χ^(2)值分别为30.561、40.776),以及HDAC8 mRNA、SMAD4 mRNA表达水平(t值分别为12.101、22.342)比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。妊娠期高血压组、轻度PE组、重度PE组胎盘组织中HDAC8、SMAD4的阳性表达率(χ^(2)值分别为21.055、15.903),以及HDAC8 mRNA、SMAD4 mRNA表达水平(F值分别为48.158、21.879)比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。HDCP组与对照组早产儿、胎儿生长受限、胎儿窘迫、新生儿窒息的发生率比较差异均有统计学意义(χ^(2)值分别为5.858、6.391、6.752、4.301,P<0.05)。妊娠结局良好组的收缩压、舒张压、24h尿蛋白及HDAC8 mRNA和SMAD4 mRNA表达水平比较,差异均有统计学意义(t值分别为2.770、5.058、3.062、7.282、6.031,P<0.05)。HDAC8 mRNA、SMAD4 mRNA及二者联合诊断HDCP孕妇发生不良妊娠结局的曲线下面积分别为0.780、0.779、0.918,二者联合诊断的曲线下面积明显高于单独诊断者(Z值分别为2.412、2.522,P<0.05)。收缩压(OR=2.895,95%CI:1.580~5.305)、舒张压(OR=2.342,95%CI:1.241~4.419)、SMAD4 mRNA(OR=2.765,95%CI:1.545~4.948)均是HDCP孕妇发生不良妊娠结局的独立危险因素(P<0.05),HDAC8 mRNA(OR=0.764,95%CI:0.638~0.915)是HDCP孕妇发生不良妊娠结局的保护因素(P<0.05)。结论HDCP孕妇胎盘组织中HDAC8表达降低,SMAD4表达升高;其与孕妇病情严重程度及不良妊娠结局有关,可能参与了HDCP的发生及发展。

miR-544在心肌梗死大鼠心肌纤维化的作用机制研究

目的探讨微小RNA 544(miR-544)在心肌梗死大鼠心肌纤维化的作用机制。方法将大鼠随机分成假手术组、模型组、转染组-1和转染组-2。假手术组、模型组心脏注射磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS),转染组-1和转染组-2分别心脏注射9型重组腺相关病毒(rAAV9)-miR-544-mimics-NC病毒载体和rAAV9-miR-544-mimics病毒载体。注射30 min后,采用无菌7-0结扎线结扎大鼠的左前降支冠状动脉的方法来构建心肌梗死大鼠模型。依次使用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色、免疫组化染色法检测各组大鼠心肌组织miR-544表达水平、心肌梗死比例、Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白的表达;荧光素酶报告基因分析miR-544与果蝇抗生物皮肤生长因子蛋白3(drosophila mothers against decapentaplegic 3,Smad3)的作用关系,以蛋白质印迹法测定大鼠心肌组织中转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)及Smad3蛋白的表达。结果假手术组、模型组、转染组-1和转染组-2大鼠心肌组织miR-544相对表达水平依次为1.02±0.08,0.43±0.16,0.40±0.14,0.68±0.04;心肌梗死比例依次为0,(58.22±0.13)%,(56.78±0.37)%,(19.86±0.15)%;Ⅰ型胶原蛋白的相对表达水平依次为1.01±0.03,4.56±0.16,4.32±0.41,2.01±0.12;Ⅲ型胶原蛋白的相对表达水平依次为0.99±0.04,7.63±0.13,7.52±0.28,2.16±0.28;TGF-β1的相对表达水平依次为1.00±0.01,4.25±0.08,4.23±0.09,1.86±0.06;Smad3的相对表达水平依次为0.99±0.02,4.73±0.13,4.75±0.11,2.25±0.07。模型组与假手术组比较,转染组-2与模型组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论miR-544能靶向调控Smad3的表达,进而阻断TGF-β1/Smad3信号通路,以发挥其抗纤维化效应。