人白血病抑制因子在果蝇细胞S2中的表达

目的克隆人白血病抑制因子基因并将其在果蝇细胞中表达。方法以人6w胚胎绒毛的总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增人白血病抑制因子cDNA,测序后将其克隆到真核表达载体C,经电穿孔法将构建的重组人白血病抑制因子质粒转染果蝇细胞S2,48h后用免疫斑点法检测人白血病抑制因子的瞬时表达情况。结果从人早孕胚胎组织获得了长度为543bp的白血病抑制因子cDNA片段,新构建的人白血病抑制因子真核表达载体中,有人白血病抑制因子cDNA的正确插入,转染人白血病抑制因子cDNA的S2细胞培养上清中含有人白血病抑制因子蛋白。结论成功地构建了人白血病抑制因子真核表达载体,人白血病抑制因子可在果蝇细胞中呈分泌性表达。

利用果蝇细胞研究基因表达转录后调控的双报告基因系统的建立

目的 构建能够在果蝇S2＊细胞中检测转录后调控元件对基因表达调控影响的双报告基因系统.方法 首先利用pAc5.1/V5-His c,pGL3-basic和pRL-SV40载体,构建能在果蝇体系中表达萤火虫荧光素酶的报告基因质粒pAc-Fluc,以及用作内参照表达海洋腔肠荧光素酶的质粒pAc-Rluc.将TNF-α基因mRNA的3＇UTR连接至pAc-Fluc的Luc编码区下游构建pAc-Fluc-TNF-α质粒,并与pAc-Rluc共转至果蝇S2＊细胞,检测两种荧光素酶的相对活性.结果 成功构建了能够在果蝇S2＊细胞中组成型表达的双报告基因系统;在TNF-α mRNA 3＇UTR控制下表达的荧光素酶活性比对照有显著下降.结论 可以利用该双报告基因系统在果蝇细胞中研究转录后调控元件对基因的表达调控.

人干扰素IFNα-2b在果蝇细胞中的稳定表达

以人干扰素IFNα-2b全长基因的质粒为模板,PCR扩增,PCR产物克隆到表达载体获得重组质粒,经转染和筛选,得到稳定表达的果蝇S2细胞株.经CuSO4诱导表达并对表达产物进行检测,结果显示,在果蝇S2细胞中成功地进行了人干扰素IFNα-2b的蛋白表达,表达产物的大小约为26kD.并且,通过体外的抗病毒活性测定,证明所表达蛋白具有抗病毒活性.该研究为进一步利用该系统表达真核细胞蛋白,研究其结构和功能提供了重要的基础.

dRASSF在果蝇细胞中负调控Dmp53的蛋白水平

从果蝇细胞cDNA文库克隆得到基因Dmp53,将该基因插入到pAc-HisB载体中,得到的重组DNA成功在果蝇S2细胞中表达.通过免疫荧光对dRASSF和Dmp53亚细胞定位进行了分析,确定了两者均是典型细胞核定位且共转染时存在共定位现象.免疫共沉淀和western blotting分析未检测到dRASSF和Dmp53之间存在相互结合作用,但是dRASSF过表达可以有效地降低Dmp53的蛋白量.为深入阐释dRASSF和Dmp53间的相互关系提供有益的线索.

对硫磷处理下果蝇细胞应激基因的高通量分析

【目的】通过对硫磷处理黑腹果蝇Drosophila melanogaster(William)的S2细胞,研究果蝇细胞在有机磷杀虫剂作用下应激基因的表达及其表达量的变化。为进一步分析昆虫应激反应及分子毒理提供研究依据。【方法】利用CCK-8试剂盒和细胞计数板检测不同浓度对硫磷处理下细胞的毒性及细胞存活率,应用基因表达谱(RNA-Seq)和实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测用药处理后细胞内基因的差异表达及表达量的变化。【结果】在35μg/m L对硫磷浓度处理下细胞活力与其他浓度相比呈现一定程度的增强,选用35μg/m L对硫磷处理的细胞做高通量基因表达谱分析显示:35μg/m L对硫磷处理细胞后扩增表达的基因有481个,差异显著表达的基因有52个,包括氧化应激基因、解毒基因和免疫相关基因的扩增或差异表达。q RT-PCR验证基因表达谱中一部分差异显著基因的表达变化与表达谱变化趋势一致。【结论】对基因的差异表达和细胞毒性检测进行了研究,为对硫磷新的作用靶标和抗性机制研究奠定了基础。

运用MTT比色法检测印楝素对果蝇S2细胞的毒力作用

采用MTT(四甲基偶氮唑蓝,methylthiazolyl-tetrazolium)法测定不同质量浓度印楝素(0.01,0.1,0.5,1.0,2.0 mg.L-1)作用不同时间(24,48,72,96 h)对果蝇S2细胞的抑制率.结果表明,印楝素低质量浓度处理时,对果蝇S2细胞有促进生长的作用,表现为低质量浓度促进效应;在质量浓度为0.1～2 mg.L-1处理剂量范围内,表现为明显的时间依赖性,随时间延长,抑制率增加.0.5 mg.L-1处理48 h抑制率达54%,为最佳作用条件.

果蝇S2细胞中高表达荧光素酶重组质粒的构建及活性测定

目的:构建果蝇S2细胞中高表达荧光素酶的重组质粒。方法:用PCR方法扩增得到pac启动子的基因片段,经酶切亚克隆至pGL3-Basic的真核表达载体中,转染果蝇S2细胞,通过测定荧光素酶和β-半乳糖苷酶的活性计算荧光素酶的相对活性。结果:构建的重组质粒在S2细胞中荧光素酶的相对活性较pGL3-Control中增加了2.7万倍。结论:成功构建了果蝇S2细胞中高表达荧光素酶的重组质粒pGL3-pac。

HCV结构蛋白E2在果蝇S2细胞中的稳定表达

目的获得在果蝇S2(S2)细胞中稳定表达的重组丙型肝炎病毒(HCV)包膜糖蛋白2(rE2)。方法 PCR扩增截短型E2基因,克隆至pCR2.1-T载体,将测序正确的基因亚克隆至表达载体pMT/Bip/V5-HisC,构建重组表达载体pMT-E2。用FuGENE HD转染试剂将pMT-E2转染至S2细胞,并筛选抗性细胞,然后诱导目的蛋白表达;以Western-blotting法鉴定表达产物与HCV感染者血清反应性。结果成功构建截短型HCV E2表达载体pMT-E2,并获得到稳定表达rE2蛋白的S2细胞株,Western-blotting法证明rE2具有良好的免疫学活性。结论在S2细胞成功表达的HCV rE2蛋白可用于HCV感染者血清的鉴定,为HCV诊断性抗原的优化和重组疫苗的研发提供了实验材料。

灭多威对果蝇胚胎S2和人肝癌HepG2细胞的遗传毒性研究

灭多威对环境中非靶标生物的毒性作用广受关注。选用果蝇胚胎S2细胞和人肝癌HepG2细胞为研究对象,采用噻唑蓝(MTT)细胞活力测定、单细胞彗星电泳和磷酸化组蛋白(γH2AX)免疫荧光印迹等方法研究了灭多威的细胞毒性。结果表明:随着灭多威浓度的升高,S2和HepG2细胞活力均呈逐渐下降趋势;两种细胞均出现显著的彗星现象,且彗星尾长增加,尾部面积增大;γH2AX阳性细胞百分率逐渐增大。表明果蝇S2和人HepG2细胞DNA受损程度随着灭多威剂量的增大而加重,灭多威可诱导细胞DNA双链断裂,最终导致细胞凋亡。灭多威具有潜在的基因毒性,长时间接触会损害人类健康。

英诺克李斯特菌侵染果蝇S2细胞后的转录组分析

【目的】英诺克李斯特菌Listeria innocua为李斯特菌属Listeria的一种非致病菌,与致病菌单增李斯特菌L.monocytogenes具有共同的毒力祖先,本文旨在研究英诺克李斯特菌侵染后宿主基因表达的变化情况,为宿主调控、防御单增李斯特菌的危害提供参考。【方法】用英诺克李斯特菌侵染果蝇S2细胞,利用转录组测序检测该细菌侵染后果蝇S2细胞的基因表达变化,采用qPCR验证英诺克李斯特菌侵染后果蝇S2细胞中差异表达的基因。【结果】英诺克李斯特侵染3 h后,宿主果蝇S2细胞中Toll/Imd信号通路发生显著上调,吞噬体和霍乱弧菌Vibrio cholerae感染信号通路显著下调;抗菌肽基因DmDef(DmDefensin)、DmDro(DmDrosomycin)、DmDpt A(DmDptericin A)、DmDpt B(DmDptericinB)、 DmMtk(DmMetchnikowin)、 DmCec A2(DmCecropinA2)、 DmAtt A(DmAttacinA)、 DmAtt B(DmAttacin B)、DmAtt D(DmAttacin D)、DmCec B(DmCecropin B)均被显著地诱导表达,其中,上调幅度最大的基因是DmDef,上调了9.805倍。qPCR验证结果显示,DmMtk、DmAtt A、DmDro和DmDef基因表达分别上调了8.180、7.533、7.204和4.569倍。【结论】英诺克李斯特菌侵染果蝇S2细胞后,变化最显著的基因类群为抗菌肽。本研究全面调查了英诺克李斯特菌侵染后宿主基因表达的变化情况,为揭示非致病菌侵染后宿主细胞的反应、细菌与宿主的互作规律提供了参考。

应用果蝇胚胎细胞表达系统分泌表达猪干扰素α的试验

干扰素作为一类具有多种生物学功能的细胞因子,已经在人类疾病的防治中得到广泛应用。在兽药行业,大量的临床试验证明了干扰素激活免疫系统快速、广谱的有效性,但干扰素蛋白的活性和使用成本一直是制约其在兽药中应用的重要因素。为了探索人工重组的干扰素在兽医临床上应用的可行性,本文应用果蝇胚胎细胞表达系统筛选出了稳定表达猪干扰素α(rPIFNα)的细胞系,利用Western blot分析了细胞筛选前后的分泌蛋白的表达情况.结果显示,稳定表达细胞系的rPIFNα表达量较高,通过细胞试验证实,分泌表达的rPIFNα具有较强的抗病毒作用。本研究首次利用果蝇胚胎表达系统稳定表达猪干扰素,对干扰素在临床上应用是一个有益的尝试。

IBDV VP2蛋白在果蝇S2细胞中的表达与抗原性分析

利用果蝇S2细胞表达鸡传染性囊病病毒(IBDV)超强毒株VP2蛋白,并检测其抗原活性。通过扩增IBDV VP2蛋白的编码基因,与果蝇S2细胞表达载体pMT/BiP/V5/HisA连接构建重组表达载体pMT/BiP/V5/HisA-VP2,将重组表达载体与筛选质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞,表达VP2融合蛋白后纯化目的蛋白,并对表达产物进行抗原性分析。Western-blotting分析表明,融合蛋白相对分子质量为49 kDa,该融合蛋白具有与VP2单抗良好的结合能力。结论 IBDV VP2融合蛋白能在果蝇S2细胞中进行有效地表达,并且能分泌到上清中,融合蛋白具有良好的抗原性,可作为诊断抗原用于该病的诊断检测。

猪圆环病毒2型结构蛋白Cap在果蝇S2细胞中稳定表达与鉴定的研究

为了表达猪圆环病毒2型(PCV-2)结构蛋白Cap并检测其表达情况,试验采用果蝇S2细胞真核表达的方法,通过扩增PCV-2 Cap蛋白的编码基因,与昆虫细胞表达载体pMT/Bip/V5-HisA连接构建重组表达载体pMT/Bip/V5-HisA-Cap,用重组表达载体与筛选质粒pCoHygro共转染S2细胞,再使用选择性培养基加压筛选出稳定的细胞株,表达Cap融合蛋白后,利用SDS-PAGE及Western-bolt研究表达产物的抗原性。结果表明:融合蛋白的分子质量约为31 ku,该蛋白能够与带有V5标签的抗体结合,说明PCV-2 Cap蛋白能在S2细胞中正确表达,并具有良好的抗原性。

剪接体蛋白SmD3在果蝇S2细胞中对U2A的影响

目的探讨小核糖核蛋白颗粒蛋白SmD3(small ribonucleoprotein particle protein SmD3,SmD3)表达改变对果蝇Schneider 2(S2)细胞中剪接体成分U2A的影响。方法通过转染构建敲减SmD3基因的S2细胞及其对照模型,并进行干涉效率验证。构建pUAS-attB-SmD3克隆,通过转染实现SmD3基因在S2细胞中的过表达。采用免疫荧光染色检测各组细胞模型中U2A蛋白的表达水平。通过荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组细胞模型中U2A mRNA的表达水平。结果选择干涉效率最优的SmD3 siRNA-1进行实验,与对照组比较,SmD3基因敲减组U2A蛋白及mRNA表达水平升高,差异均有统计学意义(P均<0.05)。成功构建pUAS-attB-SmD3克隆并在S2细胞中过表达,与对照组比较,SmD3基因过表达组U2A蛋白及mRNA表达水平降低,差异均有统计学意义(P均=0.000)。结论SmD3基因编码的剪接体核心蛋白与U2A可能在果蝇S2细胞中发挥相互拮抗的作用。

CG5844基因沉默、过表达果蝇S2胚胎细胞中的剪接体组分表达观察

目的 观察沉默、过表达CG5844基因的果蝇S2胚胎细胞中的剪接体组分(U2A)表达变化。方法 ①沉默CG5844基因表达的果蝇S2胚胎细胞CG5844基因及U2A表达观察 取S2细胞分为观察A、对照A组,分别转染siCG5844-1(CG5844 siRNA,可沉默CG5844基因表达)、空白质粒。转染48 h时采用qRT-PCR法检测细胞CG5844基因,免疫荧光法检测细胞U2A。②CG5844过表达的果蝇S2胚胎细胞CG5844基因及U2A表达观察 取S2细胞分为观察B、对照B组,分别转染pUAS-attB-CG5844(可过表达CG5844基因)、载体pUAS-attB。转染48 h时采用qRT-PCR法检测 细胞CG5844基因,免疫荧光法检测细胞U2A。结果 观察A、对照A组CG5844基因相对表达量分别为0.29±0.04、1.00± 0,二者比较, P <0.05;观察A、对照A组U2A相对表达量分别为11.34± 0.58 、1.65±0.23,二者比较, P <0.05。观察B、对照B组CG5844基因相对表达量分别为18.87±2.44、1±0,二者比较, P <0.05;观察B、对照B组U2A相对表达量分别为1.30±0.07、2.17±0.06 ,二者比较, P <0.05。结论 沉默CG5844基因的S2细胞中的U2A表达升高,过表达CG5844基因的S2细胞U2A的表达降低。CG5844可能通过调控U2A的表达,影响剪接体的功能,从而调控果蝇生殖干细胞的发生。

人SNRPN基因在果蝇S2细胞中的功能研究

目的:构建人SNRPN(hSNRPN)基因过表达质粒,观察在果蝇S2细胞中的作用,为男性不育症的功能保守性研究提供重要工具。方法:构建pUAS-HA-hSNRPN质粒,利用Ub-GAL4质粒在果蝇S2细胞中驱动pUAS-HA-hSNRPN的表达。采用Western blot和免疫荧光染色观察HA-hSNRPN融合蛋白的表达情况。通过免疫荧光染色和qRT-PCR检测hSNRPN基因对果蝇RNA剪接体亚基表达水平的影响。结果:本实验成功构建了pUAS-HA-hSNRPN过表达质粒,并利用Ub-GAL4在果蝇S2细胞中驱动HA-hSNRPN融合蛋白的表达。Western blot检测和免疫荧光染色结果均显示HA-hSNRPN融合蛋白在果蝇S2细胞中成功表达。免疫荧光染色结果显示,在果蝇S2细胞中异位表达hSNRPN基因可下调U2A蛋白。qRT-PCR结果提示,异位表达hSNRPN基因可下调果蝇RNA剪接体关键因子的表达水平。结论:本研究成功实现了HA-hSNRPN融合蛋白在果蝇S2细胞中的表达,hSNRPN可竞争性抑制果蝇RNA剪接体亚基的表达水平。

细胞极性的形成

细胞的极性形成对细胞分化、发育及其功能的发挥起着举足轻重的作用。现就线虫受精卵、果蝇卵母细胞和哺乳动物上皮细胞三类细胞极性形成的特点和异同进行阐述,并探讨了近年来三类细胞极性形成的研究进展。

EIAV gp45和HIV gp120基因在不同表达系统中表达效果比较

马传染性贫血病毒(EIAV)gp45基因编码跨膜蛋白TM,该蛋白在介导病毒与靶细胞之间的融膜过程中起关键作用。gpl20蛋白是人类免疫缺陷病毒(HIV)的外膜糖蛋白,是病毒的主要抗原。通过大肠杆菌原核表达系统和果蝇细胞真核表达系统分别表达gp45及gp120,并对其表达效果进行对比,结果表明:在大肠杆菌表达系统中,gp45可成功表达,而gp120却不能表达。在真核表达系统中,gp120成功表达,而gp45却未能表达。通过对这两种系统表达情况效果的比较,发现gp45在原核系统中表达有利,而gp120在真核系统中表达有优势,表明这些基因的表达具有特异性,本研究指导我们根据特定的基因选用适当的表达系统,以便纯化所需的目的蛋白,同时也为深入研究HIV的包膜蛋白的生物学结构特性及推动相关疫苗的研究奠定基础。

SARS-CoVSpike蛋白受体结合区的表达及纯化

目的获得稳定表达SARS冠状病毒spike蛋白受体结合区的果蝇细胞系,表达spike蛋白受体结合区。方法设计引物扩增spike蛋白受体结合区318-513片段,构建重组表达载体S318-pMT/Bip/V5-his,与pCoBlast质粒共转染果蝇S2细胞,经Blasticidin筛选得到的稳定重组细胞系,用硫酸铜诱导表达,Western-Blot检测表达产物。富集的表达产物用镍柱和RESOURCES阳离子交换树脂纯化,SDS-PAGE和Western-Blot检测纯化产物。结果重组spike蛋白受体结合区可在果蝇S2细胞中分泌表达,且具有特异免疫反应性;经镍柱和RESOURCES纯化可得到纯度达90%以上的重组蛋白。结论克隆并在真核生物中分泌表达出具免疫反应原性的spike蛋白受体结合区,镍柱和RESOURCES两步纯化可得到高纯度蛋白。

家蚕微孢子虫极管蛋白1(NbPTP1)在果蝇S2细胞中的表达与糖基化修饰

极管蛋白(Polar tube protein)是极管的主要成分,能特异性定位于微孢子虫极管,在微孢子虫侵染宿主过程中发挥重要作用。文中分析了家蚕微孢子虫极管蛋白1中潜在的O-、N-糖基化修饰位点,克隆了家蚕微孢子虫极管蛋白1全基因序列,并将其插入带有V5和His标签的真核表达载体pMT/Bip/V5-His A中,成功构建了pMT/Bip/V5-His A-NbPTP1重组质粒,经转染果蝇S2细胞后,发现NbPTP1基因能在果蝇细胞中高效表达。此外,Lectin blotting和β-消除反应分析结果表明:果蝇S2细胞内表达的NbPTP1具有O-糖基化修饰特征。以上结果为研究NbPTP1的糖基化修饰特征与其功能之间的关系提供了基础,有助于揭示微孢子虫侵染机制,建立可行有效的微孢子虫病诊断和防治措施。