基于线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ亚基(COI)基因的两种枝吻纽虫系统发育关系分析

为了探讨纽虫之间的遗传差异及亲缘关系，对取自北海和湛江的中华枝吻纽虫（Dendrorhynchus sinensis）26个样本和湛江枝吻纽虫（Dendrorhynchus zhanjiang Pnsis）3个样本的线粒体细胞色素氧化酶I亚基（COD基因部分片段进行序列测定，并结合从GenBank下载的其它纽虫序列，分析它们之间的系统发育关系。结果显示，中华枝吻纽虫26个个体共检测17个单倍型，湛江枝吻纽虫3个个体共检测到2个单倍型，其长度均为615bp；枝吻纽虫个体核苷酸序列A、T、G、C的含量相近，碱基组成均表现出A＋T含量偏倚，即A＋T含量明显高于G＋c含量。中华枝吻纽虫的17个单倍型以及湛江枝吻纽虫的2个单倍型之间的遗传距离分别为0．002-0．013和0．008；而两种枝吻纽虫COI基因序列的遗传差异很大，彼此之间的遗传距离都在0．194以上，加之分子系统树（NJ）的拓扑结构也显示，作为同属的两种枝吻纽虫没有聚成1支，而是各自成支，这些表像都支持两种枝吻纽虫分别为独立有效物种的观点。中华枝吻纽虫的17个单倍型聚为1支后，与Cerebratulus marginatus，C．1acteus聚为1大支，而湛江枝吻纽虫的2个单倍型聚为1支后，与Lineus ruber和L．lon gissimus聚为1大支，表明枝吻纽虫属（Dendrorhynchus）并非单系。

基于28SrRNA基因对3种枝吻纽虫的鉴定及其系统发育分析

中华枝吻纽虫(Dendrorhynchus sinensis)、湛江枝吻纽虫(D.zhanjiangensis)和疣多枝吻纽虫(Polydendrorhynchus papillaris)因其在形态学和组织学特征上差异较小,致使其分类地位存在争议。基于28S rRNA基因序列及形态学和组织学特征对采自北海和湛江的3种枝吻纽虫进行分类地位鉴定,结合来自GenBank的其它纽虫序列,分析了它们之间的系统发育关系。中华枝吻纽虫21个个体共检测到长度为1 045 bp的2个单倍型;湛江枝吻纽虫的4个个体的长度均为1 038 bp,共检测到2个单倍型;1个疣多枝吻纽虫个体的长度亦为1 038 bp。中华枝吻纽虫的2个单倍型以及湛江枝吻纽虫的2个单倍型之间的遗传距离均为0.001;而3种枝吻纽虫28S rRNA基因序列的遗传差异很大,彼此之间的遗传距离都在0.098以上。分子系统树(NJ)的拓扑结构也显示,3种枝吻纽虫没有聚成1支,而是各自成支,结果支持3种枝吻纽虫分别为独立有效物种;同时也表明3种枝吻纽虫并非单系,乃至枝吻纽虫属(Dendrorhynchus)的2种枝吻纽虫也并非单系。

基于16S rRNA基因的三种枝吻纽虫系统发育关系分析

测定了湛江枝吻纽虫（Dendrorhynchus zhanjiangensis）、中华枝吻纽虫（Dendrorhynchus sinensis）及疣多枝吻纽虫（Polydendrorhynchus papillaris）线粒体16S rRNA基因部分片段序列,结合从GenBank下载的其他纽虫序列,对它们之间的系统发育关系进行了分析.26个中华枝吻纽虫个体共检测到长度为467-468 bp的9个单倍型,5个湛江枝吻纽虫个体的长度均为469 bp,共检测到3个单倍型,2个疣多枝吻纽虫个体的长度均为474 bp,共享1个单倍型;核苷酸序列A、T、G、C的含量相似,碱基组成均表现出AT含量偏倚,即AT含量明显高于GC含量.中华枝吻纽虫9个单倍型之间的遗传距离和湛江枝吻纽虫3个单倍型之间的遗传距离均为0.002 1-0.004 3;而3种枝吻纽虫16S rRNA基因序列彼此之间的遗传距离却均超过0.24,显示它们之间的遗传差异特别大,分子系统树（NJ）的拓扑结构也显示,3种枝吻纽虫没有聚成1支,而是各自成支,结果支持3种枝吻纽虫分别为独立有效物种.中华枝吻纽虫与2种脑纹纽虫（Cerebratulus lacteus、C.marginatus）的遗传距离分别为0.154、0.169,明显低于与其同属的湛江枝吻纽虫的遗传距离（0.242）,表明中华枝吻纽虫与前两者的亲缘关系相对较近,而与后者的亲缘关系相对较远;在NJ树上,中华枝吻纽虫没有与湛江中华枝吻纽虫聚为1支,而是其9个单倍型聚为1支后,与2种脑纹纽虫（C.lacteus、C.marginatus）聚为1支,且有高达94%的支持率,这表明枝吻纽虫属（Dendrorhynchus）并非单系,也提示将中华枝吻纽虫划入脑纹纽虫属（Cerebratulus）会更合适.

浙江枝吻纽虫(Dendrorhynchus zhejiangensis)凝溶胶蛋白基因的原核表达产物抗肿瘤活性的研究

凝溶胶蛋白(Gelsolin)作为一种重要的肌动蛋白调节蛋白,在机体的多种生理和病理活动中发挥重要作用。本文采用细胞MTT染色法,Hoechst33342/PⅠ荧光染色和流式细胞仪技术,对浙江枝吻纽虫(Dendrorhynchus zhejiangensis)的gelsolin基因的原核表达产物(r-gelsolin)进行了体外抗肿瘤活性的研究。结果表明,30μg/ml的r-gelsolin作用于胃低分化粘液腺癌MGC803细胞24h后,细胞的增殖抑制率达到最高,约为34.53%。荧光染色显示,r-gelsolin使MGC803细胞的正常形态发生改变,细胞核出现核固缩,破裂,产生凋亡小体等现象。进一步通过流式细胞仪证实,r-gelsolin可以阻滞MGC803细胞于S、G2期,影响细胞分裂的进程,并促使细胞发生凋亡。

浙江枝吻纽虫(Dendrorhynchus zhejiangensis)凝溶胶蛋白和肌动蛋白基因的克隆与序列分析

利用已构建的浙江枝吻纽虫cDNA文库,通过PCR技术扩增得到gelsolin和actin基因的全长cDNA序列。其中,gelsolin的cDNA全长1947bp,5′-非翻译区62bp,3′-非翻译区778bp,开放阅读框1107bp,编码369个氨基酸;actin的cDNA全长为1830bp,5′-非翻译区167bp,3′-非翻译区532bp以及1131bp的开放阅读框,编码377个氨基酸。序列分析表明:gelsolin包含3个gelsolin-like(G)结构域,分别含有Ca2+、actin、PIP2结合位点,actin序列中包含了gelsolin、ATP、profiling结合位点。比对结果表明,actin基因氨基酸序列与其它物种的同源性达到94%—99%。

浙江枝吻纽虫肌动蛋白基因的原核表达及其重组蛋白的体外自组装

肌动蛋白(actin)是细胞骨架的主要成分。细胞内肌动蛋白通过与actin结合蛋白(actin binding proteins,ABPs)相互作用,形成以F-actin为基础多种ABPs参与装配的高度有序的超分子聚合结构,行使各种重要生理功能。根据已获得的浙江枝吻纽虫actin的全长cDNA序列,构建actin的原核表达质粒pET-28a-A,并转化至E.coliBL21菌株,经IPTG诱导后,重组蛋白以包涵体的形式被大量表达。重组蛋白经Ni-NTA Agarose亲和层析分离纯化后,进一步透析复性,SDS-PAGE显示纯化复性后的r-actin的相对分子量约为43 kD,在体外聚合条件下,采用激光原子力显微镜(atomic forcem icroscope,AFM)技术,对r-actin通过自装配过程形成的大尺度聚集结构进行观察和分析。研究发现,r-actin在体外通过自装配过程除了形成无序的蛋白堆积物之外,还能够聚合形成复杂的离散结构,包括树状分支的纤维丛、无规卷曲的纤维簇等。Actin自装配过程反映了其固有的聚合热力学特性,深入探索将有助于进一步研究ABPs在体内actin超分子聚合结构体系装配中的调控作用及其分子机制。

浙江枝吻纽虫吻的形态学研究

采用组织学、电镜技术等手段对浙江枝吻纽虫吻的生物学特性进行了研究,阐述浙江枝吻纽虫吻的结构与其他分枝纽虫吻的组织结构异同。研究结果表明,浙江枝吻纽虫吻为一条长的肌肉组织的管道结构,一端连着头部组织,一端延伸在一个封闭的空腔中。吻腔环肌层与体壁环肌层没有交叉点,但是吻腔壁背面的环肌与体壁背面的环肌通过一束肌肉而交织在一起。在吻壁处富含大量的分泌细胞和神经细胞。当吻离体后,在普通海水中伸缩能维持2～4 h。

浙江枝吻纽虫(Dendrorhynchus zhejiangensis)热休克蛋白70基因克隆与表达特征研究

采用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆了浙江枝吻纽虫热休克蛋白70(DzHSP70)基因全长cDNA序列,并利用荧光定量PCR方法,分析了该基因在重金属胁迫下的表达特征。结果表明,DzHSP70cDNA全长2827bp,包括294bp的5’UTR、628bp的3’UTR和编码634个氨基酸残基的1905bp的开放阅读框。HSP70家族的3个签名序列以及细胞质特异性调控基序EEVD等特征元件在DzHSP70中高度保守。重金属离子Fe3+、Pb2+和Cd2+均可上调该基因的表达,其中Pb2+的毒理效应最强。研究结果表明DzHSP70可能参与了机体对于重金属的解毒过程。

浙江沿海最新发现一种枝吻类纽虫

在浙江省东部奉化市沿海的虾塘中发现了一种中间为肉红色,两端为橘红色的扁平且细,能在水里同蛇一样的侧泳动物。刺激该动物时,就会把乳白色、树枝状结构的吻喷出体外。吻结构和运动均同目前已报到的湛江中华枝吻纽虫、湛江枝吻纽虫、疣多枝吻纽虫有很大差别。暂定该纽虫为浙江枝吻纽虫,详细的分类地位还需进一步的研究。