枝状枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)发酵产酶培养基的响应面法优化

采用响应面法对枝状枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)产葡聚糖内切酶(CMCase)的液体发酵培养基进行优化。用单因素试验确定发酵培养基的最佳碳源、氮源和无机盐;通过中心组合试验和响应面法优化以上因素,得到的优化发酵培养基为:麦秸23.18 g.L-1、麦麸30.00 g.L-1、酵母膏13.62 g.L-1、KH2PO44.60 g.L-1、NaCl 4.60 g.L-1、MgSO4.7 H2O 0.46 g.L-1。在此条件下,该菌发酵液中CMCase活力达2.80 U.mL-1,较优化前提高了2.18倍。

枝状枝孢菌F4-1液体发酵产纤维素酶及部分酶学性质研究

对纤维素酶产生菌Cladosporium cladosporioides F4-1液体发酵产纤维素酶的条件及其降解纤维素的最适温度和pH等进行研究。采用DNS法,对CMCase(羧甲基纤维钠素酶)活性进行测定,对F4-1菌株的发酵时间、初始pH、装液量、接种量和温度等产酶条件及部分酶学性质进行研究。结果表明,菌株F4-1在pH5.0、接种量7%、装液量50mL、28℃发酵4d,得到的CMCase酶活力为3.94U/mL,较优化前提高1.48倍;CMCase作用的最适温度为50℃,最适pH为5.0。通过以上研究,有效地提高菌株F4-1产CMCase的活性。

枝状枝孢霉MD2的Unigene A09801克隆与原核表达分析

真菌紫杉醇合成酶类基因的功能研究是构建紫杉醇高产工程菌株的前提。首次从产紫杉醇真菌——枝状枝孢霉MD2中克隆了Unigene A09801的DNA和c DNA全长序列(1674 bp),该基因不含有内含子,其编码产物含557个氨基酸,与GMC(glucose-methanol-choline)oxidoreductase一致性为56%,蛋白分子质量为61 291.8 u,等电点为5.47,不存在跨膜结构和信号肽。Unigene A09801以单拷贝方式存在于基因组中,其表达量受茉莉酸甲酯诱导表现出先降低后升高再降低的趋势,最高表达量出现在24 h。构建了Unigene A09801的原核表达载体,并初步优化其表达条件为:诱导温度32℃,IPTG浓度1.2 mmol/L,诱导时间4 h。结果为体外(in vitro)分析该基因编码蛋白的催化功能奠定了基础。

枝状枝孢引起皮肤暗色丝孢霉病1例

目的报道1例枝状枝孢引起的皮肤暗色丝孢霉病。方法采用10％KOH镜检、真菌培养、小培养、温度试验、明胶液化试验、体外药敏试验、组织病理检查。结果皮损脓液10％KOH镜检见有棕黄色分隔菌丝；沙堡弱培养基（SDA）培养出局限性、绒状、橄榄绿色菌落；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）小培养，孢梗多侧生于菌丝上，不分枝，产孢后不延伸、不膨大，淡褐色，具孢痕，枝孢呈长三角形，分生孢子顶生或侧生于其上，形成分枝的孢子链；最适应生长温度为25—27℃；能液化明胶。因此，本菌株符合枝状枝孢特征。而皮损组织病理显示真皮内弥漫性炎性细胞浸润以及肉芽肿病理相，伴有真菌菌丝孢子侵犯，诊断为皮肤暗色丝孢霉病。体外药敏试验结果显示本菌株对伊曲康唑敏感，给予患者口服0．4g／d，8周后皮损基本消退，目前仍在服药及随访。结论本病例的致病菌为枝状枝孢，选用伊曲康唑治疗有效。

枝状枝孢霉MD2的Unigene A03231的克隆及原核表达分析

为研究真菌紫杉醇合成相关基因的功能,从产紫杉醇真菌枝状枝孢霉MD2中克隆了Unigene A03231的DNA和c DNA全长序列(918 bp).结果表明:该基因不含内含子,其编码产物含305个氨基酸,与短链脱氢酶/还原酶一致性为64%,预测蛋白分子量为33071.5 Da,不存在信号肽,含有2个跨膜结构.Unigene A03231以单拷贝形式存在于基因组,在0~30 h内其表达水平随茉莉酸甲酯诱导表现为先升高后降低.构建了该基因的原核表达菌株,初步优化了其在大肠杆菌BL21中的诱导表达条件为:诱导温度28℃,IPTG浓度0.6 mmol/L,诱导时间8 h.为深入分析该基因的催化功能奠定了基础.

枝状枝孢霉MD2的候选基因A00981的克隆及转基因菌株的构建

目的:为揭示真菌紫杉醇合成分子机制.方法:克隆了产紫杉醇内生真菌枝状枝孢霉MD2的候选基因A00981,该基因DNA和cDNA序列分别为969 bp和894 bp;其编码蛋白含有298个氨基酸、无跨膜结构和信号肽,与酰基辅酶A脱氢酶(ACAD)具有73%的一致性.进一步构建该基因的超表达载体pTFC-A00981,并转化枝状枝孢霉MD2,共获得9株转基因菌株.结果:Southern blot分析证明其中5株转基因菌株的外源基因是以单拷贝方式插入.结论:该结果为深入分析超表达候选基因A00981对枝状枝孢霉MD2紫杉烷类合成的影响奠定了基础.

产阿魏酸酯酶的枝状枝孢霉筛选、发酵特性及在黄酒中应用研究

筛选高产阿魏酸酯酶菌株,并对其发酵特性及在黄酒中的应用进行研究。通过初筛及复筛,根据菌落形态、生理生化特征及rDNA ITS1-5.8S-ITS2基因序列的系统发育树构建分析进行菌株鉴定;以阿魏酸含量为衡量指标,考察温度、初始pH、麦麸添加量、酒度等因素对菌株发酵过程中产阿魏酸的影响;菌株经过富集培养反添加到黄酒酿造过程中。筛选出一株高产阿魏酸酯酶霉菌,经分子鉴定为枝状枝孢霉菌株(Cladosporium cladosporioides),保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M2015549。菌株在30℃、pH 4.8、麦麸添加量5%、酒度9%条件下培养3 d,菌株产阿魏酸酯酶活力最高可达175.4 U/L。当菌株添加量为0.010%时,黄酒阿魏酸含量提高到150%。筛选到一株新的高产阿魏酸酯酶的枝状枝孢霉菌株,并将其反添加到黄酒酿造过程中,对黄酒阿魏酸含量的提高起到积极作用,证明菌株在产阿魏酸酯酶及富含阿魏酸功能性食品开发方面具有很大潜力。

枝状枝孢菌次级代谢产物的研究

目的 :研究枝状枝孢菌大米固体发酵后产生的次级代谢产物。方法 :采用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、高效液相色谱等方法进行分离纯化,以及NMR、MS等现代波谱手段进行结构鉴定。结果 :分离得到6个单体化合物,分别鉴定为:6,8-二羟基-3-甲基-1H-异铬-1-酮、6-甲氧基-8-羟基-3-甲基异香豆素、豆甾-4-烯-3-酮、3β-羟基-5α,8α-过氧化麦角甾-6,22-二烯、腺嘌呤核苷、甘露醇。结论 :化合物1～3为首次从该植物内生真菌中分离得到。

杀菌剂对茶花致病菌枝状枝孢菌室内药效试验

利用50%嘧菌酯水分散粒剂、12%咯菌腈悬浮剂、6%春雷霉素可湿性粉剂、50%多菌灵可湿性粉剂,采用生长速率法对茶花叶片致病菌枝状枝孢菌进行了室内药效试验,测定几种杀菌剂的抑菌率,为田间防治提供依据。结果表明:50%多菌灵可湿性粉剂对该病原菌具有较强的抑制作用,抑菌率可达94.8%,12%咯菌腈悬浮剂和50%嘧菌酯水分散粒剂的抑菌效果次之,而6%春雷霉素可湿性粉剂对其基本无抑制作用。

产紫杉醇内生真菌枝状枝孢霉MD2的发酵条件优化

【目的】通过优化内生真菌枝状枝孢霉MD2的发酵条件,提高10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB)和紫杉醇(Taxol)的产量。【方法】采用单因素试验分析不同的培养基初始pH值、培养温度、摇床转速和培养时间对10-DAB和紫杉醇产量的影响,优化枝状枝孢霉MD2的培养条件;以YES为基本培养基,采用单因素试验和正交试验分析添加苯甲酸钠、苯丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸4种前体物对10-DAB和紫杉醇产量的影响,优化枝状枝孢霉MD2的培养基组分。【结果】优化后发酵条件为:在初始pH为5.0的300 mL YES培养基中,添加15 mg/L苯甲酸钠、25 mg/L苯丙氨酸、5 mg/L丝氨酸、15 mg/L甘氨酸,接种1 mL枝状枝孢霉MD2的孢子悬液(107 108个孢子/mL),28.0°C、220 r/min发酵培养12 d。在此条件下,枝状枝孢霉MD2的生物量、10-DAB和紫杉醇的产量分别为15.5 g/L、471.5μg/L和569.5μg/L,与初始发酵条件相比,分别提高了1.3、3.6和3.4倍。【结论】首次获得了枝状枝孢霉MD2生产10-DAB和紫杉醇的较适摇瓶发酵条件,可为进一步放大发酵培养提供参考。

中国枝孢属的分类研究──3个新记录种8个已知种

主要报道枝孢属３个国内新记录种及其详细描述：二胞枝孢（ＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍｂｉｓｐｏｒｕｍＭａｔｓｕｓｈｉｍａ），桉枝孢（Ｃ．ｅｕｌｙｐｌｉＦ．Ｔａｓｓｉ．），枝状枝孢豌豆生变型（Ｃ．ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓｆｏｒｍａｐｉｓｉｃｏｌａ（Ｓｎｙｄｅｒ）ｄｅＶｒｉｅｓ），标本存于云南农业ｋ学植物病理重点实验室真菌标本室（ＭＨＹＡＵ）。

深色有隔内生真菌S12菌株遗传转化体系的建立及GFP标记菌株的获得

【目的】建立深色有隔内生真菌(dark septate endophyte,DSE)的遗传转化体系,获得绿色荧光蛋白(GFP)标记的DSE转化子,为研究DSE在植物根系的侵染定殖行为和侵染定殖规律奠定基础。【方法】以前期从健康枸杞根系分离的1株DSE菌株枝状枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)S12菌株为供试材料,确定潮霉素B对其的最低抑制质量浓度,然后研究菌龄(13,15,17,19和21 h)、酶解时间(1.0,1.5,2.0,2.5,3.0和3.5 h)、崩溃酶质量浓度(10,15,20,25,30和35 mg/mL)和渗透压稳定剂种类(NaCl、KCl、CaCl_(2)和MgSO_(4))对S12菌株原生质体制备的影响。采用聚乙二醇(PEG)介导原生质体转化法将PDL2质粒(含hph和gfp基因)转入S12菌株,对所获转化子进行表型、GFP荧光、PCR及拮抗活性(以尖孢镰刀菌枸杞专化型Fusarium oxysporum f.sp.Lycium barbarum LR-1菌株为靶标菌)检测,筛选与野生型S12菌株无明显差异且带有GFP标记的转化子。【结果】S12菌株在YPD液体培养基中培养17 h,以0.7 mol/L NaCl为稳渗剂,用30 mg/mL的崩溃酶酶解2.5 h,原生质体制备数量最多,为4.53×10^(6)mL^(-1)。通过PEG介导,将PDL2质粒(含hph和gfp基因)转入S12菌株,可得47株转化子,转化效率2.35株/μg,从中筛选出10株生长速度和产孢量与野生型S12菌株无明显差异的转化子。荧光观察、PCR和拮抗活性检测结果表明,外源基因已成功整合到S12菌株中,成功建立了S12菌株的遗传转化体系,并获得了GFP标记菌株,有6株转化子对LR-1菌株的抑菌率与野生型S12菌株无明显差异。【结论】成功建立了遗传稳定性良好的S12菌株遗传转化体系,筛选出了6株抑菌效果与野生型菌株相当的转化子。

枝孢状枝孢霉与常见致病性暗色真菌基因多态性研究

目的研究枝孢状枝孢霉及常见致病性暗色真菌基因多态性,初步了解它们在同属内与同种内、属间与种间的基因遗传相似性及遗传变异性。方法随机扩增DNA多态性(RAPD)分析:应用GenTLETM DNA提取试剂盒提取菌丝体DNA,以RAPD法对18株暗色真菌的DNA指纹图谱进行分析。结果共选用10个随机引物进行扩增,筛选出3个具有稳定、清晰DNA扩增带型的引物(引物1、4、5);18株真菌DNA带型不完全相同,有一定的种间和种内的遗传变异性和遗传相似性,腐生菌枝孢状枝孢霉与其他部分暗色真菌位于同一树组中;同种真菌并不都具有遗传相似性。结论RAPD分析表明,包括枝孢状枝孢霉在内的暗色真菌在属内各种间不一定有遗传相似性;但腐生菌与致病菌的DNA带型未见明显特征性差异,似乎还有一定遗传相似性。

杧果露水斑病病原菌生物学特性测定

【目的】明确杧果新病害露水斑病病原菌(Cladosporium cladosporioides)的生物学特性,以便为该病害的发生规律研究提供理论依据。【方法】测定了不同条件对病原菌菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响。【结果】菌丝在杧果葡萄糖琼胶培养基和PDA培养基上生长最佳,最适生长温度20℃,最适p H值7~8,光照对菌丝生长影响不明显,菌丝对有机碳源乳糖和有机氮源氨基乙酸利用最好,菌丝致死温度为50℃、10 min;产孢量以25℃、p H 6、光暗交替、麦芽糖为碳源、L-胱氨酸为氮源时最大;分生孢子萌发率以25℃、p H7、液态水、有机碳源阿拉伯糖、有机氮源L-天冬氨酸为最适条件,分生孢子致死温度50℃、10 min。【结论】杧果露水斑病菌喜好20~25℃、弱酸至弱碱、高湿、富含有机营养的环境。

高效降解纤维素真菌的筛选与鉴定

采集校园内腐质土壤,利用刚果红羧甲基纤维素钠初筛培养基、干稻草粉产酶培养基,通过水解圈与菌落直径的比值、滤纸酶活筛选及微生物鉴定得到高效降解植物纤维素的霉菌。结果表明,在刚果红初筛培养基上筛选出一株高产纤维素酶霉菌,其产滤纸酶活达到247.48U/mL。通过菌落形态、镜下形态及转化感受态细胞DH5α,鉴定出此霉菌为枝状枝孢霉(Cladosporium cladosporioides),具有较高的降解天然纤维素的能力,是一株有研究开发潜力的纤维素酶生产菌株。

藜麦穗腐病病原鉴定及其生物学特性

2019—2020年在山西省藜麦种植基地发现一种穗腐病.通过病原菌分离、致病性测定、形态特征观察及rDNA-ITS、翻译延长因子(TEF1-α)和微丝肌动蛋白(ACT)基因序列分析,对该病害的病原菌种类进行鉴定,并测定了碳源、氮源、温度和pH值对其菌落生长的影响.结果表明,藜麦穗腐病的病原菌为枝状枝孢(Cladosporium cladosporioides),以葡萄糖为碳源和草酸铵为氮源的培养基有利于枝状枝孢菌株LMSF-1的生长;该菌株生长的最适温度为25℃,最适pH值为7.

我国杧果露水斑病研究进展

杧果露水斑病是近年来为害日益严重的重要病害之一,染病果皮表面会出现水浸状病斑,严重影响果实的外观品质,降低商品价值,造成经济损失,甚至会导致失去市场竞争力。本文对杧果露水斑病的发生史、症状与为害、病原菌与发病规律、检测与防治技术等方面所取得的研究进展进行综述,为病害防治提供参考依据。

广西香蕉煤污病病原菌的分离鉴定及其生物学特性

香蕉是我国南方的重要特色作物,香蕉煤污病的发生降低了果实品质,严重影响其市场价值,给蕉农造成经济损失。为明确广西香蕉上新发生煤污病的病原及其生物学特性,采用单孢分离法获得病原菌株BFMY-2,并依据柯赫氏法则验证其为广西香蕉煤污病的病原菌。通过rDNA-ITS和SSU序列分析并结合形态学鉴定,将病原菌鉴定为枝状枝孢霉(Cladosporium cladosporioides),该菌引起的香蕉煤污病为首次报道。生物学特性测试结果表明,该菌最适生长温度为28℃;最适生长pH为6.0~7.0;可利用11种供试碳源和12种供试氮源,最适碳源为果糖和木糖,最适氮源为甘氨酸;在相对湿度大于或等于80%时孢子才能萌发,最适湿度为100%。

红花洋蹄甲新病害叶霉病病原菌鉴定

2012年5月笔者在海南大学儋州校区发现了一种严重为害红花洋蹄甲叶部的新病害,为了确定引起该病害的病原菌,对红花洋蹄甲病叶进行了组织分离,对纯化后的病原菌进行了致病性测定、形态学鉴定和rDNA-ITS序列鉴定,确定引起该新病害的病原菌为枝状枝孢(Cladosporium cladosporioides)。定名该病害为红花洋蹄甲叶霉病。

紫杉醇合成相关候选基因A02725的克隆及转基因菌株的构建

真菌紫杉醇合成相关基因的功能研究是揭示真菌紫杉醇合成机制的关键。为了揭示产紫杉醇内生真菌枝状枝孢霉MD2的候选基因A02725对宿主紫杉烷类合成的作用,本研究克隆了候选基因A02725的DNA全长序列(1 524 bp);生物信息学预测结果表明该基因编码蛋白为亲水蛋白,含508个氨基酸,无信号肽和跨膜结构,与牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)具有79%的一致性;进一步构建该基因的超表达载体并转化枝状枝孢霉MD2,通过抗性筛选以及Southern blot检测,共获得27株转基因菌株,其中5株转基因菌株的外源基因是以单拷贝方式整合。该结果为深入分析超表达候选基因A02725对宿主紫杉烷类合成的影响奠定了基础。