穿梭质粒匹配pHT254电转枯草芽孢杆菌WB800N方法优化

目的 枯草芽孢杆菌虽已广泛应用,但不同质粒转化困难或成本较高,限制了其应用。本研究主要观察了生长培养基、电击缓冲液、复苏培养基中添加如山梨醇、甘露醇、聚乙二醇等不同组合添加剂对枯草芽孢杆菌转化效率及稳定性的影响。方法 用穿梭质粒PHT254电转化枯草芽孢杆菌WB800N,研究生长培养基、电击缓冲液和复苏培养基等因素对转化效率的影响。结果 同一电场压力下高渗体系转化效率较常规体系明显提高且稳定性较好,同一电场压力和高渗体系中使用聚乙二醇PEG6000的电击缓冲液转化效率比使用山梨醇或海藻糖高6倍。结论 高渗电击转化法能够提高转化的稳定性,使用聚乙二醇PEG6000作为缓冲液可以获得更高的电转化效率。

产顺式-4-羟脯氨酸枯草芽孢杆菌工程菌的构建及发酵优化

顺式-4-羟脯氨酸(CHOP)是一种重要的手性结构物质,可广泛用于药物以及香料制造。本研究为开发CHOP的生物合成方法,将来源于中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的L-脯氨酸-4-羟化酶在枯草芽孢杆菌WB800N中实现了成功表达,构建获得了能够以L-脯氨酸为底物合成CHOP的工程菌株,进而对该菌株的发酵条件以及发酵组分进行了优化研究。结果表明:工程菌株的最适发酵温度为25℃,最适诱导剂浓度为1 mmol/L,最适发酵p H为5;在发酵体系中加入5 mmol/L硫酸亚铁和2.5 g/L L-脯氨酸时最有利于合成CHOP。在最优发酵体系下发酵60 h后,顺式-4-羟脯氨酸的产量可以达到120.2 mg/L。本文成功的构建了羟脯氨酸生产菌株枯草杆菌WB800 p HT-P4H,而研究结果为枯草杆菌工程菌发酵生产顺式-4-羟铺氨酸提供了基础。

Cloning and Expression of Extremely Heat-Resistant Endo-β-1,4-Glucanase Gene from Thermotoga maritima in Bacillus subtilis

Gene encoding endo-β-1,4-glucanase(TM1525)is derived from Thermotoga maritima(T.maritima),which has an open reading frame of 825 bp and encodes a 274 amino acid endo-β-1,4-glucanase.This enzyme has the same high temperature resistance as thermophilic bacteria,which is an ideal property for industrial applications.By molecular biological means,TM1525 was cloned into pHT43 vector and introduced into Bacillus subtilis(B.subtilis)WB800N by electroporation.The results showed that the WB800N expression system was successfully constructed,and extracellular expression of the recombinant gene was achieved.Cellulose hydrolyzed activity of the protein was exhibited.

一株皮革脱毛用工程菌的构建及酶法脱毛应用

构建一株低胶原蛋白酶活力枯草工程菌,用于皮革脱毛并研究其脱毛特性。以Bacillus subtilis AS1.398中性蛋白酶基因为模板,聚合酶链式反应(PCR)扩增得到中性蛋白酶基因npr,并借助p HT43质粒转化至蛋白酶缺陷型宿主菌WB800N中,培养并经过1mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导,发酵液上清经SDS-PAGE电泳证明重组蛋白表达成功,经明胶平板验证重组菌株胶原蛋白酶表达能力显著低于野生菌株AS1.398。扩大培养获得重组中性蛋白酶,对牛皮进行脱毛试验表明:重组中性蛋白酶初始脱毛速率大于野生菌株AS1.398蛋白酶;7h到达脱毛终点,且此时脱毛液中羟脯氨酸值(13μg/m L)较低;经显微及感官鉴定重组中性蛋白酶脱毛后皮块毛孔清晰可见,不损伤皮粒面。综上,重组蛋白酶可以在不损害皮质量的前提下完成脱毛过程,为酶法脱毛制革提供新的技术支撑。