枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的固定化研究

采用酰胺交联法将葡萄糖酸冼必泰修饰在载体上,并优化了修饰后的载体对中性蛋白酶的结合条件及催化活性的影响。结果表明,葡萄糖酸冼必泰对载体的修饰条件及修饰后的载体对中性蛋白酶的固定条件为:葡萄糖酸冼必泰的添加量为0.095 mmol、树脂活化时间为1 h、载体羧基与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)摩尔比为1∶3、中性蛋白酶的添加量为600 U,酶活化时EDC的添加量为13.7 mg。在此条件下,固定化中性蛋白酶的酶活性可达398 U/g树脂。经傅立叶红外分析,枯草芽孢杆菌中性蛋白酶成功的交联到修饰有亲和配基的亲和树脂载体上。经过固定后,固定化酶的米氏常数Km值为2.9 mg/mL,游离酶的Km值为1.7 mg/mL,随意固定化酶的Km值为7.1 mg/mL。

枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的研究进展

中性蛋白酶因作用条件温和广泛应用于食品、医药以及饲料等领域。枯草芽孢杆菌为肠道益生菌,且具有较强的蛋白酶活性而受到极大关注。该文对枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的特性与应用、提高枯草芽孢杆菌中性蛋白酶活力的途径以及枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的分离纯化方法进行了综述,并对存在的问题进行了分析与展望,旨在为枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的深入研究提供参考。

枯草芽孢杆菌发酵蟹壳粉产蛋白酶的研究

本试验由蟹壳粉和蔗糖组成蟹壳粉培养基,通过测定发酵液中的蛋白酶活来确定最佳的培养基组成成分,利用单因素试验和响应面优化的方法优化蟹壳粉培养基,使枯草芽孢杆菌发酵蟹壳粉来产蛋白酶,提高废弃蟹壳的回收率,减少对环境的污染。试验结果表明:当蟹壳粉的浓度为5.12%,枯草芽孢杆菌的接种量为3.02%,蔗糖浓度为11.00%,初始pH为7.07时,枯草芽孢杆菌发酵蟹壳粉产酶的酶活最大值为17.4220 U/mL,较单因素试验时的最高蛋白酶酶活力14.2290 U/mL有一定的提升。

1株边鸡源产蛋白酶枯草芽孢杆菌的分离鉴定与生物学特性研究

该试验旨在筛选具有高产蛋白酶能力的益生芽孢杆菌,扩大微生态制剂候选菌株资源。以边鸡直肠内容物为分离来源,经脱脂奶粉平板初筛获得16株产蛋白酶菌株,液体发酵复筛后,选取1株蛋白酶活力高达119.7 U/mL的芽孢杆菌FRE76进行后续研究。通过16S rRNA基因测序与进化树分析,并结合形态学与生理生化鉴定,判定该菌株为枯草芽孢杆菌。病原菌抑制试验表明,该菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用。耐酸和耐胆盐检测发现,在pH值3.0和4.0时该菌株存活率均为50%以上,在胆盐浓度为0.1%和0.3%时菌株存活率均能达到60%以上。该试验筛选获得的枯草芽孢杆菌FRE76,具有优良的蛋白酶生产性能、较好的致病菌抑制能力和较强的抗逆性,是一株潜在的益生菌菌株。

信号肽筛选和核糖体结合位点优化的组合策略提高角蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的胞外表达

角蛋白酶(keratinase)是一类能够特异性降解角蛋白的蛋白酶,在废弃物回收、皮革纺织和饲料添加等领域有着广泛的应用前景。然而,较低的胞外蛋白含量仍是重组角蛋白酶开发的主要问题。前期研究中已经获得了1株重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600-p43NMK-Ker,在摇瓶水平下,其胞外角蛋白酶活力为10.4 kU/mL,在SDS-PAGE分析中发现角蛋白酶所在条带颜色较浅,说明其胞外表达量较低。该研究考察了信号肽和核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)对角蛋白酶胞外表达量的影响。通过枯草芽孢杆菌内源信号肽替换,筛选得到的带有SP_(dacB)的重组菌株的分泌能力显著提升,其胞外角蛋白酶活力达到84.3 kU/mL,约为出发菌株胞外酶活力的8.1倍。在此基础上,通过对RBS进行基于高效突变位点的半理性预测的饱和突变,筛选得到的1株高产菌株R16D12,其胞外酶活力达到109.1 kU/mL,较RBS优化前提高了29%,是出发菌株胞外酶活力的10.5倍。研究结果表明,信号肽筛选和RBS优化的组合策略显著提高了角蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的胞外表达量,为后续研究与应用奠定了基础。

枯草芽孢杆菌高产中性蛋白酶发酵条件的优化

通过单因素试验和正交试验对枯草芽孢杆菌10075菌株发酵产中性蛋白酶的培养基组分及培养条件进行优化,达到提高菌株中性蛋白酶产量的目的。结果表明,发酵培养基的最佳组分:添加麦芽糖8.0%、蛋白胨4.0%、MgSO4 0.08%;最适发酵条件为发酵温度37℃、初始pH 7.0、发酵时间42 h,酶活力由最初的98.36 U/mL提高到353.45 U/mL。

胰凝乳蛋白酶SplB在枯草芽孢杆菌中的重组表达及应用

通过启动子优化、宿主筛选,构建了C端带His-tag的胰凝乳蛋白酶类蛋白酶SplB表达载体,成功实现了SplB在枯草芽孢杆菌中的重组表达,对纯化的重组SplB进行酶学性质研究,并实现了重组蛋白酶SplB在重组蛋白Prx标签切割中的应用。结果表明,以枯草芽孢杆菌ATCC6051Δ10为宿主,通过启动子P_(43)介导的重组蛋白酶SplB表达活力最高(10.24 U/mL)。通过亲和层析纯化了重组表达的SplB,并进行酶学性质研究,其最适温度为40℃,最适pH值为8.5,且具有良好的温度和pH值稳定性。在离子浓度较低情况下,Co^(2+)对重组SplB活力有促进作用,Mg^(2+)、K^(+)不影响酶活力;而Cu^(2+)、Zn^(2+)、Ni^(+)离子抑制SplB活力;十二烷基硫酸钠极大抑制重组SplB活力。将重组SplB应用于切割重组蛋白Prx的标签,结果表明,重组SplB具有WELQ肽段标签切割作用,并且SplB浓度越高,目标条带越浓。本研究为优化SplB的重组表达及在食品、医药领域的应用提供支持。

枯草芽孢杆菌ZC-7中性蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究

枯草芽孢杆菌ZC-7的发酵液,经离心分离得到粗酶液,再经硫酸铵盐析、中空纤维膜除盐浓缩、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、SephadexG-75柱层析等步骤获得电泳纯的中性蛋白酶。SDS-PAGE测得其分子量大约为42kDa。以酪蛋白为底物时,该酶的Km为5×10-3,Vmax为2.5×104μg/min,酶的最适作用pH为7.0,最适反应温度为55℃,在pH6.5～8.0,40℃以下较稳定,对1mol/Lh2O2具有一定的耐受性。EDTA、异丙醇和乙醇对该酶有抑制作用,Ca2+、Mg2+和Li+离子对其具有保护作用。

枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的特性及补料研究

采用分离纯化的枯草芽孢杆菌进行产中性蛋白酶的研究,结果表明:适宜的碳源和氮源分别为玉米粉和豆粕粉;磷酸盐能提高酶产量;未添加Na2HPO4和KH2PO4的情况下,Ca2+和Mg2+对产酶都有抑制作用;Na2HPO4和KH2PO4存在时,1 mmol/L的Ca2+和Mg2+能使酶产量分别提高12%和8%,随着离子浓度的增加,产酶受到抑制;采用在11 h、18 h和24 h分别补加10 g/L玉米粉和7.5 g/L豆粕粉的补加策略,产量提高了96%,生产强度提高了112%。

枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件优化

对1株枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵培养基以及发酵条件进行了优化,最终确定了摇瓶最佳发酵培养基为:甘油40 g/L、豆粕粉30 g/L、麸皮10 g/L、Na2HPO44 g/L、K2HPO40.3 g/L。摇床最佳发酵条件为:温度30℃、转速250 r/min、接种量体积分数6%,在此发酵条件下,酶活达到6 082.7 U/m L,发酵强度为56 U/(m L·h)。在15 L发酵罐进行了初步验证,通过流加甘油分批发酵,在第25h酶活达到最大值,为11 871 U/m L。

枯草芽孢杆菌AS1.398中性蛋白酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达

将编码枯草芽孢杆菌AS1.398 的中性蛋白酶功能区和包含前导区序列(“pro”序列)在内的全长基因克隆到酵母整合型质粒pPIC9K中,电转化His4 缺陷型巴斯德毕赤酵母SMD1168,通过MD-G418平板、PCR方法筛选和鉴定重组子。重组子发酵液经SDS-PAGE分析和酶活测定表明,枯草芽孢杆菌AS1.398的全长中性蛋白酶基因在毕赤酵母中获得了高效表达,表达产物分泌至培养基中,分子量约为43kD。经甲醇诱导培养后,发酵液中的中性蛋白酶活力达20000 U/mL。

枯草芽孢杆菌ZC1发酵产中性蛋白酶的条件优化

在摇瓶发酵条件下,对枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶条件进行优化。在单因素的基础上,通过Plackett-Burman实验和最徒爬坡实验确定出响应面实验设计的中心点:豆粕粉66g/L,麦芽糖16g/L及磷酸二氢钾8.5g/L。通过响应面实验设计,得到最佳发酵条件为:豆粕粉67.13g/L,麦芽糖16.17g/L,磷酸二氢钾8.52g/L,吐温-80 3mL/L,海藻糖3g/L,pH 7.5,接种量4%,温度37℃。在该发酵条件下发酵72h,中性蛋白酶酶活由原来的454.2U/mL提高到993.1U/mL。

枯草芽孢杆菌B111中性蛋白酶基因BS2在毕赤酵母中的表达

【目的】为开发抗病基因和生物农药新资源,纯化鉴定枯草芽孢杆菌B111分泌的抗棉花黄萎病菌蛋白质,克隆其编码基因,并分析在毕赤酵母中的表达特性。【方法】通过超滤浓缩、90%硫酸铵沉淀、葡聚糖凝胶QAE-A50强阴离子交换柱洗脱及冻干等步骤,分离纯化抗菌蛋白。采用联机反相毛细管柱液相色谱电喷雾串联质谱,鉴定抗菌蛋白种类。克隆包含前导区序列在内的抗菌蛋白基因序列,构建表达载体pPIC9K-PT,转化毕赤酵母GS115。转化子经PCR鉴定,甲醇诱导表达产物经中性蛋白酶活性和抗菌活性检测验证功能。【结果】纯化鉴定了一个来源于枯草芽孢杆菌B111的抗菌中性蛋白酶BS2。克隆了包含前导区序列在内的抗菌蛋白基因BS2,并在毕赤酵母中获得有效表达。重组BS2蛋白分子量约69kD,表达水平29.77mg·L-1,水解酪素酶活力27800U·g-1,并显示抗黄萎病菌活性。【结论】纯化鉴定了一个具有抗菌活性的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶BS2,克隆其编码基因BS2,并成功实现在酵母中的有效表达。

枯草芽孢杆菌中性蛋白酶基因的克隆与表达

本研究对枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的基因进行克隆,并在大肠杆菌中诱导表达。从枯草芽孢杆菌基因组克隆到编码中性蛋白酶的全长基因,构建大肠杆菌原核表达载体pET30b,转化大肠杆菌BL21得到重组工程菌。通过菌落PCR和酶切筛选验证重组体。在25℃,110 r/min条件下,用IPTG诱导重组蛋白表达。表达蛋白用SDS-PAGE验证,并对酶活力进行测定。测序结果表明克隆序列与NCBI上的登录的序列同源性高达99%。SDS-PAGE结果表明诱导出的蛋白相对分子质量56.6 kD,酶活力达到39 U/mL。证明成功克隆得到枯草芽孢杆菌中性蛋白酶基因,并在大肠杆菌中得到高效表达。

重组枯草芽孢杆菌产角蛋白酶的发酵培养基及发酵条件优化

角蛋白是潜在的优良饲用蛋白资源,其中角蛋白酶作为可特异性降解角蛋白的酶类,在角蛋白饲料化领域展现出广泛的应用潜力和价值。本研究以自主构建的重组角蛋白酶工程菌枯草芽孢杆菌WB600-pMA5-kerJY-23为研究对象,利用单因素和二次通用旋转组合设计试验对其摇瓶发酵产角蛋白酶的发酵培养基和发酵条件进行优化。结果表明:该菌株最佳发酵产酶条件为:葡萄糖25 g/L,蔗糖25 g/L,酵母浸膏20 g/L,硫酸铵10 g/L,磷酸氢二钾1.5 g/L,氯化钠0.3 g/L,氯化钙0.025 g/L,硫酸镁0.025 g/L,硫酸亚铁0.015 g/L,氯化锰0.05 g/L,初始pH 8,装液量45 mL/250 mL三角瓶,接种量6%,培养温度37℃,摇床转速200 r/min,发酵周期36 h。在该优化条件下,重组枯草芽孢杆菌WB600发酵产角蛋白酶的酶活达到(2110±15.011)U/mL,较优化前提高了5.10倍(P<0.05),为该酶在角蛋白降解及资源化利用领域的应用提供了理论依据与研究基础。

枯草芽孢杆菌L1发酵产中性蛋白酶活性的研究

中性蛋白酶在工业上具有广泛的应用,文中以豆粕为主要氮源,探讨了枯草芽孢杆菌L1菌株发酵豆粕产中性蛋白酶的酶活性。在单因素试验的基础上,通过正交试验优化了枯草芽孢杆菌L1产中性蛋白酶的发酵条件,即豆粕粉浓度为2.0%,葡萄糖为1.0%,接种量为7%,发酵温度为36℃,其发酵液的中性蛋白酶活力可达68.7U/m L。

枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的发酵条件优化

文章对一株枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的发酵条件进行了优化,采用单因素试验和正交试验确定了最优发酵条件为装液量60 ml/250 ml,转速200 r/min,初始pH值6.9,发酵周期60 h,接种量4%,发酵温度37℃。通过发酵条件的优化,酶活提高了311.7%。

枯草芽孢杆菌B．subtilis ML中性蛋白酶基因的克隆及鉴定

以蛋白酶高产菌株Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＭＬ为供体菌，提取其染色体ＤＮＡ，经限制性内切酶ＢａｍＨＩ完全酶切后，插入枯草杆菌载体ｐＮＱ１２２的相同酶切位点，连接后转化中性碱性蛋白酶基因双缺陷型菌株Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＤＢ１０４。从含有氯霉素的酪蛋白平板上获得了２０个具有蛋白酶活性的克隆。测定了克隆菌的蛋白酶活性和抗性，对来自部分阳性克隆的重组质粒进行了Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，其中３个与已知的中性蛋白酶基因有很强的同源性。经对这３个阳性克隆的蛋白酶活性抑制试验以及分泌蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，可确定存在着中性蛋白酶基因的表达产物。从这３个阳性克隆中获得的重组质粒，被分别命名为ｐＭＰＲ４、ｐＭＰＲ８和ｐＭＰＲ１６。

枯草芽孢杆菌B.subtilis CNMC-0014深层摇瓶发酵生产中性蛋白酶——培养基组分及培养条件对酶生物合成的影响

应用统计学方法优化了B.sustilis CNMC-0014中性蛋白酶产生的培养基组分。单因素试验研究发现,在测试的6种碳源中,以甘油和玉米粉对产酶影响显著,酶活力分别达到了3955.16±2.15U/ml和3939.15±1.87U/ml。氮源试验中发现,大豆粉对产酶影响最为显著,酶活力达到4318.12±5.66U/ml。通过极差分析与正交分析优化了培养基配比,优化方案为:2%玉米粉,1%甘油,3%玉米粉和3%麸皮。方差分析结果发现,甘油和玉米粉对产酶影响显著(p<0.05),大豆粉对产酶极显著(p<0.01),麸皮对产酶影响不显著(p>0.05)。同时,还研究了金属离子、溶氧、起始pH值、菌龄以及接种量对产酶的影响,研究结果表明,Ca2+、Mg2+、Na+、Zn+、Mn2+可以在不同程度对产酶有激活作用,特别是Ca2+,酶活力达到了4552.97U/ml,而Fe3+、Fe2+、K+、Ag+对产酶有强烈的抑制作用,特别是Ag+(酶活力仅为987.46U/ml),最适摇瓶装量为50ml/300ml,最佳起始pH值为7.5,最佳菌龄与接种量分别为24h和3%。

不同信号肽及分子伴侣对中性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中分泌表达的影响

通过筛选5个不同的信号肽基因(AmyE、AprE、NprE、SacB、YncM)代替对照质粒pHT43-npr上原始的信号肽基因,整合2个不同的分子伴侣(PrsA、DnaK)到pHT43-npr质粒上,构建重组质粒并转化到枯草芽孢杆菌WB800N中进行诱导表达。结果表明,构建了5株信号肽重组菌株,通过牛奶平板验证无明显水解圈,通过酶活性比较,5株重组菌株中性蛋白酶活性均显著低于对照菌株;成功构建了2株整合分子伴侣的重组菌株,通过牛奶平板验证有水解圈,通过酶活性比较,两株菌株均表达中性蛋白酶,其中重组菌株WB800N/pHT43-npr-PrsA产蛋白酶活性比对照菌株WB800N/pHT43-npr提高了23%,重组菌株WB800N/pHT43-npr-DnaK产蛋白酶活性比对照菌株提高了33%。