绿色荧光蛋白基因标记内生枯草芽孢杆菌

用枯草芽孢杆菌168菌株rpsD基因的启动子替换质粒pGFP4412中蜡状芽孢杆菌4412启动子,从而构建了能在枯草芽孢杆菌中表达绿色荧光蛋白基因gfpmut3a的载体pS4GFP,将其导入具有内生、防病、促生作用的野生型枯草芽孢杆菌BS-2菌株中,筛选获得遗传稳定性好且具有良好发光表型的标记菌株BS-2-gfp.该标记菌株在小白菜体内的定殖研究结果表明,该菌株能够在小白菜根际及根、茎、叶内定殖和传导,接菌50d后仍能在其体内分离到标记菌株.

内生拮抗枯草芽孢杆菌BS-2菌株的发酵条件

内生拮抗细菌BS 2菌株在以黄豆粉为原料的 3号培养基中生长速度快 ,发酵滤液对辣椒炭疽病菌的抑制作用强 ,菌液对辣椒果炭疽病的防效最好。培养基初始 pH值、培养时间、温度、通气量等对菌株生长及其抗菌物质的分泌有明显影响。结果表明 ,以黄豆粉培养基、初始 pH值 6 .7(灭菌后 )、2 8℃、培养 4 8h、并尽量增大培养通气量 ,为菌株的最佳发酵条件。

辣椒内生枯草芽孢杆菌BS-2和BS-1防治香蕉炭疽病

来自辣椒体内的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BS-2和BS-1菌株对香蕉炭疽菌菌丝生长、分生孢子形成及萌发等有较强的抑制作用.接种病菌16d后,两菌株对香蕉炭疽病防治效果达34.0%(BS-1)-90.0%(BS-2),其中BS-2的防效比BS-1高.

西瓜内生枯草芽孢杆菌BS211的拮抗活性及盆栽防效

对从西瓜植株体内分离得到的内生拮抗枯草芽孢杆菌BS211的抗菌谱进行了测定;用5种培养基对BS211菌进行培养,测定了这5种BS211菌培养液无菌滤液的抑菌活性;采用硫酸铵沉淀法提取BS211菌抗菌粗提物,并测定了抗菌粗提物的抑菌活性和温度稳定性;运用砂培和盆栽方法进行BS211菌对西瓜枯萎病的防效试验;测定了BS211菌的宿主范围。结果表明:BS211菌对西瓜枯萎病菌等12种病菌都具有强烈的拮抗作用,而且拮抗性能稳定;BS211菌在5种培养基中的生长量没有显著差异而且均能产生抗菌物质,但在不同培养基中产生的抗菌物质的抑菌能力有差异;BS211菌液的硫酸铵沉淀物及上清液对不同病菌的抗性存在差异,说明BS211菌株产生的抗菌物质为复合物;BS211菌抗菌粗提物具有较好的温度稳定性,尤其是硫酸铵沉淀的上清液部分经121℃处理30 m in后活性无明显变化,对番茄青枯病菌仍有强烈的抑菌作用;BS211菌对西瓜枯萎病有显著防效;BS211菌能在辣椒等多种作物体内定殖,有较强的宿主适应性。

桑树内生拮抗细菌枯草芽孢杆菌L144对植物生长及营养代谢的影响

桑树内生拮抗细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)L144对多种植物病原菌具有较强的抑制作用。为进一步探讨该内生菌的开发应用价值,研究了该内生菌对植物生长及营养代谢的影响。试验结果表明:适当浓度的L144菌株培养液能明显提高玉米和桑树种子的发芽势、发芽率和胚根长,增加玉米和桑树幼苗的株高及植株鲜质量和干质量,提高植株体内叶绿素、可溶性蛋白和可溶性糖的含量,且以菌株培养液10倍稀释液的促生作用最为显著;该菌株的菌体悬浮液及胞外分泌物对玉米幼苗也表现出不同程度的促生作用;该菌株还具有分泌植物生长激素、溶解无机磷和有机磷的性能,有可能是其促进植株生长的主要作用机制。试验结果提示,L144菌株的培养液及菌体和胞外分泌物对植物有较明显的促生作用。

内生枯草芽孢杆菌E1R-J对萝卜、白菜促生作用

通过萝卜、白菜的种子萌发试验、幼苗盆栽试验以及小区试验,对小麦内生枯草芽孢杆菌E1R-J菌株的促生作用进行了研究。结果表明:E1R-J无菌滤液不同浓度稀释液及菌悬液可促进白菜种子的萌发,使萌芽整齐、萌发率增高。其无菌滤液10倍稀释液浇灌处理的盆栽白菜幼苗,株高、鲜质量、干质量分别比清水对照增长53%、200%和700%。同时发现,浇灌处理的盆栽萝卜幼苗与清水对照相比,株高、鲜质量、干质量也分别增长24.4%、215%和159%。田间小区试验结果也证明内生枯草芽孢杆菌E1R-J具有促生作用,但促生效果低于盆栽试验。利用丙酮直接浸提法测定盆栽白菜叶片中的叶绿素含量,发现无菌滤液10倍稀释液和菌悬液10倍稀释液处理的叶绿素含量增高2倍左右。

植物内生枯草芽孢杆菌E1R-j脂肽类化合物的分离鉴定及抑菌作用

植物内生枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis菌株E1R-j分离自小麦根部。以小麦全蚀病菌作为靶标菌,采用酸沉淀、快速蛋白液相色谱(FPLC)和基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDITOF/TOF-M S)技术,对该菌发酵液中的抗真菌活性物质进行分离鉴定和抑菌活性研究。结果表明:菌株E1R-j产生的抗菌活性物质由P1、P2、P3和P4 4类组分组成,其中P3起主要抑菌作用。M ALDI-TOF/TOF-M S分析结果显示,P3为fengycins。经试验发现,P3对温度稳定,121℃下放置30 min仍可保持抑菌活性。电子显微境观察发现,P3对小麦全蚀病菌菌丝生长有强烈的抑制作用,同时还可造成菌丝细胞畸形、细胞壁溃解、细胞质外渗等。

内生枯草芽孢杆菌B-001菌株内生定殖研究及生物学特性

用浸种、浸根、淋根、伤茎、伤叶和喷雾等接种方法测试枯草芽孢杆菌B-001菌株入侵烟草植株的途径,发现该菌可通过自然孔口和伤口入侵寄主植物;取接种植株的茎部组织切片在电镜下观察,发现该菌株在烟草的微管束和细胞内定殖。生长特性研究结果表明该菌株最适生长pH为7.5,最适生长温度为30℃,48～96h内处于稳定生长期。

油菜内生枯草芽孢杆菌BY-2抗油菜菌核病菌有效成分的鉴定和分离提纯

油菜内生枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BY-2产生2种类型的抗真菌物质,一种是挥发性的物质,可以有效地抑制油菜菌核病菌的生长;另一种是分泌到培养液中的物质。重点研究第二类抗菌物质的提取和纯化分析方法。试验证明BY-2产生和积累高效抑制油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum(L ib.)de Bary)生长的细胞外分泌型物质,其发酵上清液与油菜菌核病菌对峙培养形成了2.8 cm的抑菌圈;采用离心收集发酵液上清液、调节酸性条件、甲醇溶解和Sephadex G25葡聚糖凝胶柱层析等方法,可以沉淀、萃取收集和纯化该物质,而且收集率高、活性强、纯度高。

水稻内生枯草芽孢杆菌对稻瘟病菌和稻恶苗病菌的抑制作用

自水稻茎和根内分离获得的枯草芽孢杆菌J215和G87菌株培养菌液和滤液对稻瘟病菌和稻恶苗病菌具有较强的抑制作用。其培养菌液（10～9cfu/ml）稀释2～100倍时,对稻瘟病菌和稻恶苗病菌菌丝生长抑制分别为83.6%～91.0%和60%左右;培养滤液稀释2倍时抑制率达52.4%～75.4%。细菌培养滤液处理能破坏病菌菌丝形态,使稻瘟病菌菌丝细胞膨大、细胞壁破损、原生质外渗、菌体崩溃;但对稻恶苗病菌菌丝损坏较轻,主要使菌丝细胞膨大、生长缓慢。另外,细菌培养滤液稀释10倍时对稻瘟病菌分生孢子形成和萌发的抑制分别达85%和95%以上;对稻恶苗病菌分生孢子形成和萌发的抑制率分别为90%和60%以上。

内生枯草芽孢杆菌BS-2对水稻苗生长的效应

结果表明:内生枯草芽孢杆菌BS2(Bacillussubtilis)菌株含量为103cfu·mL-1时即可进入水稻体内定殖;该菌的菌体、不同菌液含量及外分泌物对水稻苗生长均表现出不同程度的促进作用,如增加植株的鲜重与干重.从其促生机理来看,该菌能提高水稻叶绿素的含量,提高其保护酶活性,并通过提高水稻对外界环境的适应性,提高其抗逆性,促进其生长.

苦参内生枯草芽孢杆菌B_(36)抗菌物质对番茄叶霉病菌的作用机制

采用大孔树脂吸附法提取苦参内生细菌B36的抗菌物质,研究其对番茄叶霉病菌的作用机制。结果表明,菌株B36抗菌物质粗提物对番茄叶霉病菌抑菌圈直径达20.5mm;引起菌丝畸形,产生囊泡;抑制分生孢子萌发。当抗菌物质浓度为10.6×10^2μg/ml时,对孢子萌发的抑制率达86.56%;果胶酶和羧甲基纤维素酶的酶活分别为0.5911和0.01757U/ml,显著低于对照。说明B36抗菌物质抑制两种菌丝胞外细胞壁水解酶的合成,通过破坏细胞膜结构产生抑菌作用,而抗菌物质对病菌菌丝细胞壁组成物质几丁质和菌丝蛋白质的浓度没有影响。

桑树内生枯草芽孢杆菌TasA基因的克隆及序列分析与表达产物的抑菌作用

TasA是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在芽孢的形成过程中产生的蛋白,对多种动、植物病原菌有较强的抑制作用。从桑树内生枯草芽孢杆菌菌株ME0717基因组DNA中克隆到TasA基因的全序列,包含一个786bp的完整开放阅读框(ORF),GenBank登录号为FJ713582。该序列与来源于B.subtilis的已知同源TasA序列Z99116、AJ871386的相似性达99.0%和98.1%,与芽孢形成相关的基因YqhF(GenBank登录号:BACJH642)的序列相似性也达99.0%,而与来源于地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的TasA序列(GenBank登录号:AE017333)相似性仅有46.0%,与来源于其它芽孢杆菌属的金属蛋白酶基因和芽孢外壳相关蛋白基因也有较高的相似性。构建该基因的原核表达载体,并在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中获得表达,表达产物对桑疫病病原细菌的菌体生长以及桑漆斑病菌和桑炭疽病菌的菌丝生长均有一定程度的抑制作用。

内生枯草芽孢杆菌BS-2防治荔枝霜疫病及其生化机理

研究内生枯草芽孢杆菌BS-2(Bacillus subtilis)菌株对荔枝采后果实霜疫病的防治效果,及其对体内活性氧代谢(SOD、POD、CAT、MDA、超氧阴离子自由基的产生速率)和病程相关蛋白(β-1,3葡聚糖酶活性、几丁质酶活性)等的影响。结果表明,BS-2菌株对荔枝霜疫病具有较好的防治效果,接种处理后6d,其防治效果为37.83%;经内生细菌处理的荔枝果皮的β-1,3葡聚糖酶活性、几丁质酶活性、CAT和SOD酶活性均比病菌处理的高,而POD、PPO酶活性以及膜透性、MDA含量与超氧阴离子自由基的产生速率却比病菌处理的低。当接种后6d,经内生细菌处理的荔枝果皮的β-1,3葡聚糖酶活性、几丁质酶活性和SOD酶活性分别比病菌处理的高70.73%、30.76%和297.43%;而POD、PPO酶活性和超氧阴离子自由基的产生速率却分别比病菌处理的低15.11%、4.96%和28.95%。

生防内生枯草芽孢杆菌Jaas ed1在西瓜植株内的定殖能力检测

分别对枯草芽孢杆菌Jaas ed1进行利福平(Rif)抗性标记和绿色荧光蛋白(GFP)标记,获得Rif抗性标记的菌株Jaas ed1R及GFP标记的菌株Jaas ed1-GFP,并初步研究Jaas ed1在西瓜植株中的定殖能力。定殖结果表明,在灌根接种Jaas ed1R后的35 d内能在西瓜苗根部检测到Jaas ed1R,20 d内能在茎部检测到Jaas ed1R;并且在根部定殖的数量显著大于茎部,接种后3 d根部Jaas ed1R的数量为1.62×104cfu·g-1鲜重,茎部为2.95×102cfu·g-1鲜重。灌根接种Jaas ed1-GFP后的第3天,在荧光显微镜下观察到西瓜苗根部存在大量的Jaas ed1-GFP,在激光共聚焦显微镜观察到西瓜苗茎内的Jaas ed1-GFP分布集中在维管束中。说明内生枯草芽孢杆菌Jaas ed1能够在西瓜植株体内定殖,能够从土壤中进入西瓜根部组织,并且能够侵入到茎部微管束组织中,从而在整个植株体内转移。

内生枯草芽孢杆菌HD-1β-甘露聚糖酶基因的克隆及结构生物学分析

采用PCR技术从一株内生枯草芽孢杆菌HD-1基因组DNA中扩增出β-甘露聚糖酶基因核苷酸编码序列.序列分析表明,该基因全长1 089bp,编码362个氨基酸和一个终止密码子,N端前27个氨基酸为其信号肽.该酶氨基酸序列与相同来源的β-甘露糖苷酶同源性最高达98.34%,具有ManB保守结构域,属于糖苷水解酶家族26的一员.通过对该酶分子三维结构的预测分析,该酶的催化域形成TIM桶状结构,Cys92和Cys112形成二硫键,它们之间的部分构成该酶的氧化还原反应的活性中心,Glu100和Glu292分别为该酶的酸碱催化位点和亲核催化位点.三维结构的分析为提高酶的催化活性的和功能方面的定向改造提供了依据.

内生枯草芽孢杆菌Em7抑菌物质的产生条件及其活性

为研究内生枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Em7抑菌物质产生条件及其特性,以油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)为指示菌,采用单因素和正交试验测定不同培养基成分及培养条件对菌株Em7抑菌物质产生的影响。结果显示,菌株Em7的最佳培养基配方为:麸皮20g/L,牛肉膏10g/L,MnSO41.5g/L;当培养基初始pH=7.0,接种量φ=1%,250mL摇瓶装液量为50mL时,在28℃,150r/min培养获得的培养液抑菌活性最强。此外,菌株Em7的抑菌物质能够抑制10多种重要植物病原菌的菌丝生长、孢子萌发,并致使病菌菌丝出现细胞质外渗、膨大,致使病菌孢子出现顶端膨大、不能正常形成芽管等畸形发育。

一株甘蓝内生枯草芽孢杆菌16S rDNA序列的克隆与分析

台州学院生命科学学院实验室前期从甘蓝健康植株中分离到一株内生细菌GL06,为甘蓝内生枯草芽孢杆菌GL06的功能研究和生产应用奠定基础,利用PCR法克隆其16S rDNA序列,并进行生物信息学分析。结果表明:以27F/1492R为PCR引物,扩增到长度为1 510bp的16S rDNA序列,序列的GC含量为54%;GL06 16S与枯草芽孢杆菌16S的相似性最高,达99%,仅存在3个碱基差异;GL06与枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌的系统发育树聚为一组。

内生枯草芽孢杆菌B215对香蕉弯孢霉叶斑病抑制作用初探

通过香蕉内生枯草芽孢杆菌菌株B215对峙培养及其菌体代谢物的活性测定结果表明,B215菌株对香蕉弯孢霉叶斑病原真菌具有很强的拮抗作用,其对峙培养能明显抑制靶标菌菌丝向四周均匀扩展,抑菌带宽度为0.4 cm;菌株滤液的EC50值达5.10%,主要是以代谢产物中的抗菌物质造成孢子和菌丝膨大成球状畸形,原生质外泄,孢子崩溃干瘪,致使病菌丧失侵染和繁殖能力。

内生枯草芽孢杆菌B215对香蕉炭疽菌抑制作用初探

对香蕉内生枯草芽孢杆菌菌株B215的对峙培养和菌体代谢物的活性测定。结果表明B215对香蕉炭疽病原真菌具有较强的拮抗作用,对峙培养明显抑制靶标菌菌丝向四周均匀扩展,抑菌带宽度0.4cm,菌株滤液的EC50值达4.99%。