枯草芽孢杆菌HB-32产3-羟基丁酮分批发酵动力学

对草芽孢杆菌HB-32分批发酵过程中菌体细胞生长、3-羟基丁酮的形成以及葡萄糖的消耗随发酵时间的变化规律进行研究。基于Logistic方程和Luedeking-Piret方程,建立3-羟基丁酮分批发酵过程中细胞生长、产物合成以及基质消耗随时间变化的数学模型。对动力学模型的拟合曲线进行分析,发现模型的计算值能与实验值较好地拟合,拟合模型R2均大于0.98,表明建立的动力学模型能较好地反映3-羟基丁酮分批发酵过程。

枯草芽孢杆菌产3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇发酵条件优化

研究以一株从古井窖泥中分离筛选的枯草芽孢杆菌为出发菌株,进行发酵培养成分和发酵条件优化。与静置发酵相比,振荡培养可有效提高菌株发酵液中3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇的产量;在振荡培养的基础上采用正交试验方法对发酵培养基和培养条件进行了优化。实验结果表明,枯草芽孢杆菌发酵培养的最佳条件为:3mmol/L Mg^(2+),15g/L蛋白胨,150r/min,32℃。与初始静置发酵条件相比,最优条件下3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇(左旋)、2,3-丁二醇(内消旋)的产量分别提高了57.75%、1234.96%、163.33%。

重组枯草芽孢杆菌全细胞催化高效合成2′-脱氧腺苷

以枯草芽孢杆菌168(简写为BS)为宿主,以脱氧胸苷和腺嘌呤为底物,异源表达组合来源于大肠杆菌(E.coli)的嘧啶核苷磷酸化酶(PyNP)与嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)作为催化酶源,全细胞催化合成2′-脱氧腺苷(dA)。首先,以BS敲除内源性的PNP(由基因deoD编码,Gene ID:940038)后的菌株BS0为出发菌株,经过PyNP1酶(来源于E.coli,Gene ID:948901)与PNP3酶(来源于E.coli,Gene ID:945654)的重组表达得到CW3,再优化PyNP1与PNP3的对核糖体结合位点(RBS)序列得到重组菌株CW3-3,在CW3-3作用下,dA的产量为133.4 g/L,脱氧胸苷的转化率为64.3%;其次,以CW3-3为出发菌株,利用互作短肽构建自组装多酶复合物,经过PyNP1酶N端融合RIAD,PNP3酶C端融合RIDD(其中RIAD和RIDD为互作短肽标签)处理后,PyNP1酶N端融合4个RIAD标签得到重组菌株CW17,在其作用下,dA的产量达到179.6 g/L,显著提升了底物转化率;最后,对重组菌株CW17全细胞催化条件细胞添加质量浓度及催化反应温度进行了优化,在细胞添加质量浓度为150g/L,反应温度50℃条件下,dA的产量达到200.3g/L,脱氧胸苷的转化率为96.6%。

枯草芽孢杆菌结合3506-2基质使用防治甘蓝根肿病药效试验初报

本研究比较了5种不同措施防治甘蓝根肿痛的效果,结果表明:采用枯草芽孢杆菌粉剂(2.0×10~6cfu/g)400倍液结合3506—2基质处理防治根肿病平均发病率最低(13.70%)、病情指数最低(5.23)、防治效果最好(79.12%)、产量最高(8 094.05kg/667m^2),而且无农药残留,成本约180元/667m^2,符合生产绿色甘蓝食品发展方向,建议在大田防治甘蓝根肿痛中推广应用。

D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达

将D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPE)基因利用PCR进行扩增,与枯草芽孢杆菌载体p MA5连接,构建重组质粒p MA5-cbdpe。重组质粒转入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB800感受态细胞,利用卡那霉素筛选和PCR鉴定,获得一株DPE重组枯草芽孢杆菌菌株。该重组菌株无需诱导即可产生DPE酶,18 h时酶活可达6.8 U/m L。该酶最适p H为7.0,最适温度为55℃,与大肠杆菌表达的DPE酶酶学性质相似。结果表明,DPE酶可在枯草芽孢杆菌中表达。

紫外诱变选育高产3-羟基丁酮枯草芽孢杆菌

选育高产3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌新菌株。采用紫外诱变(15W,25cm),对一株产3-羟基丁酮枯草芽孢杆菌YD-1进行紫外诱变处理,并对菌株的遗传稳定性进行测定。筛选获得4株高产菌MB-2、MB-6、MB-10和MB-11,经过20代传代培养后MB-2的遗传稳定性最好,其遗传物质经RAPD分析,与出发菌株YD-1相比有较大差异。该菌遗传性状稳定,是一株高产3-羟基丁酮的新菌株。

复合诱变选育高产3-羟基丁酮枯草芽孢杆菌

选育高产3-羟基丁酮枯草芽孢杆菌,将一株枯草芽孢杆菌YD-1作为出发菌株,通过紫外线、硫酸二乙酯反复诱变处理,选取每一轮发酵3-羟基丁酮产量最高的菌株进入下一轮诱变。结果表明,菌株的复合诱变条件是在照射距离为25 cm时紫外诱变30 s后再经10%的硫酸二乙酯诱变处理30 min,然后进行有利突变株的筛选,通过初筛、复筛和遗传稳定性试验,获得1株遗传性状稳定的3-羟基丁酮高产菌,其产量高达19.02 g/L,比诱变前提高了50.95%,其遗传物质经RAPD分析,与出发菌株YD-1相比有较大差异。得到的枯草芽孢杆菌新菌株3-羟基丁酮产量高而残糖量低。

多粘类芽孢杆菌同步糖化发酵玉米粉生产(R，R)-2，3-丁二醇

【目的】对多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa的玉米粉同步糖化发酵工艺进行优化,以获得低成本、高效的(R,R)-2,3-丁二醇生产技术。【方法】研究玉米粉浓度、氮源种类和氮源浓度对菌体生长、耗糖能力以及(R,R)-2,3-丁二醇产量、产率、得率和转化率的影响,并在此基础上进一步考察培养基中其它成分对(R,R)-2,3-丁二醇发酵的影响。【结果】优化后的培养基组分为玉米干粉140g/L,酵母粉30g/L,Na_2HPO_4 3g/L,KH_2PO_43g/L,(NH_4)2SO_42g/L,MgSO_40.8g/L,微量元素溶液2mL/L。使用优化后的培养基进行同步糖化发酵,发酵50h后(R,R)-2,3-丁二醇产量达到56.28g/L(光学纯度为98.3%),对葡萄糖的得率为0.44g/g,产率为1.13g/(L·h)。【结论】(R,R)-2,3-丁二醇生产技术低价高效,可为其工业化生产提供参考。

响应面法优化枯草芽孢杆菌3-羟基丁酮发酵培养基

采用响应面法对枯草芽孢杆菌TH-55 3-羟基丁酮发酵培养基进行了优化,确定了葡萄糖、酵母浸膏和玉米浆是影响菌株3-羟基丁酮发酵产率的主要因素。优化获得的发酵培养基组成:葡萄糖102g/L,酵母浸提物6.8g/L,玉米浆26.5g/L,硫酸铵5g/L,硫酸锰0.05g/L,硫酸镁0.6g/L,磷酸二氢钾0.5g/L。在此条件下,菌株摇瓶发酵3-羟基丁酮平均产率达到46.25g/L,较优化前的菌株产率35.21g/L相比提高了31%。10L发酵罐发酵试验,发酵周期72h,3-羟基丁酮发酵产率达到47.85g/L。

一株高产3-羟基丁酮枯草芽孢杆菌的构建

以产3-羟基丁酮枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TH-49(Val^-)和产α-乙酰乳酸脱羧酶地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)AD-30为亲本菌株,以聚乙二醇为融合促进剂,进行原生质体融合获得融合子,融合子经再生、筛选等过程,最终获得高产3-羟基丁酮菌株HB-32,该菌株3-羟基丁酮产量高达49.64 g/L,比菌株TH-49(Val-)提高了61.8%,且遗传稳定性良好。进一步采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术,从分子水平上分析了高产3-羟基丁酮菌株HB-32与亲本菌株基因组的变化。结果表明,枯草芽孢杆菌(B.subtilis)TH-49(Val^-)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)AD-30原生质体融合成功,提高了融合子HB-32 3-羟基丁酮产量。

利用地衣芽孢杆菌发酵生产3-羟基-2-丁酮初步研究

初步研究了摇瓶条件下地衣芽孢杆菌发酵生产3-羟基-2-丁酮的工艺条件。分析了摇瓶发酵中菌体生长、产物合成和pH的变化情况;考察了发酵温度、装液量、种龄、接种量等条件对发酵的影响;研究了地衣芽孢杆菌利用不同碳源发酵生产3-羟基-2-丁酮的情况,选取了最适碳源,在此基础上进行了补糖试验;最后采用正交试验方法对培养基进行了优化。在优化的发酵条件下,采用分批补糖的工艺,摇瓶发酵产量可稳定在20 g/L以上,为3-羟基-2-丁酮的工业化生产提供了一定的基础。

枯草芽孢杆菌产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的发酵优化

D-阿洛酮糖是D-果糖在C-3位的差向异构体,由于较低的热量和与蔗糖相似的甜度,D-阿洛酮糖成为一个具有发展前景的功能性甜味剂。D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,EC 5.1.3.30,DPEase)能够催化D-果糖生产D-阿洛酮糖,这种生物酶法制备的功能性甜味剂D-阿洛酮糖由于简单的纯化步骤和高产物浓度等优点受到关注。该研究对1株前期构建的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 1A751/pUB-P43dpe-dal产DPEase进行了3 L发酵罐水平培养,通过优化溶解氧(DO)、pH、温度、初始碳源质量浓度确定最适发酵条件为:DO为30%、pH 6.0、温度37℃、初始葡萄糖质量浓度15 g/L,最高发酵酶活达78.3 U/mL。在此基础上进行补料发酵优化,得到最适补料条件为:在发酵5 h进行补料,碳源补料速率8.0 g/(L·h),在此条件下,发酵9 h全细胞酶活高达123.0 U/mL。此发酵策略为扩大工业化生产提供了参考。

D-阿洛酮糖3-差向异构酶在枯草芽孢杆菌中的表达

D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,DPE)可以催化D-果糖转化为稀有糖D-阿洛酮糖,是生产D-阿洛酮糖过程中的关键酶。为了提高DPE的表达水平,该研究以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB800为宿主菌,异源表达Clostridium scindens ATCC 35704来源的DPE。首先,构建不同单启动子和串联启动子介导DPE表达的重组菌,通过摇瓶培养,发现由单启动子P_(hag)介导的重组菌株经发酵后酶活力最高,最高酶活力为19.62 U/mL,是P_(43)介导的原始菌株酶活力的1.3倍。最后对P_(hag)的核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)序列进行突变,突变后的菌株酶活力再次提高了29.4%,是原始菌株酶活力的1.69倍。该研究结果为工业化生产DPE提供了方法学参考。

枯草芽孢杆菌ATCC6633催化7-苯乙酰胺基-3-Z-丙烯基-3-头孢菌素-4-对甲氧基苄酯的水解

以枯草芽孢杆菌ATCC6633菌体为催化剂,催化头孢丙烯中间体顺式7-苯乙酰胺基-3-Z-丙烯基-3-头孢菌素-4-对甲氧基苄酯(顺式GPRE)水解生成顺式7-苯乙酰胺基-3-Z-丙烯基-3-头孢菌素-4-羧酸(顺式GPRA),经过优化反应产率达63%。而脂肪酶Novozyme 435和Amino PS IM均无此活性。

饲料中添加枯草芽孢杆菌制剂对肉鹅生长性能及粪便中NH3和H2S去除效果的影响

为探讨饲料中添加枯草芽孢杆菌制剂对肉鹅生长性能及粪便中NH3和H2S去除效果的影响,试验选用体重相近肉鹅240只,随机分为4组,每组3个重复,每个重复20只,1组为空白对照组饲喂基础日粮,试验2、3、4组分别在基础日粮中添加1.5%、2.0%、2.5%复合枯草芽孢杆菌制剂,预试验为7 d,试验期28 d。试验结束测定肉鹅生长性能和粪便中NH3和H2S的含量。结果表明:试验2、3、4组平均日采食量均高于1组(P > 0.05),试验3、4组的试验末重和平均日增重较1组分别提高17.3%、16.67%、12.06%、9.75%(P < 0.05),试验3、4组的料重比较1组分别降低15.60%、8.51%(P < 0.05);试验3、4组粪便中的H2S和NH3含量较1组分别降低26.34%、25.95%、31.99%、25.35%(P < 0.05)。综上所述,在基础饲料中添加2.0%复合枯草芽孢杆菌制剂可以提高肉鹅的生产性能,降低粪便中NH3和H2S的含量。

枯草芽孢杆菌菌株ZT4-2电击转化体系的建立

【目的】建立枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株ZT4-2的高效电击转化体系。【方法】带有荧光蛋白标记的穿梭质粒pGFP78,通过电击转化法将其转入枯草芽孢杆菌菌株ZT4-2。【结果】菌株培养阶段、感受态细胞浓度、感受态细胞量、质粒体积量、转化电压等条件的不同,会对电击转化效率造成影响。其中试验条件:制备感受态细胞的菌株培养阶段的OD_(600 nm)值=1.0,重悬菌体时每100mL起始菌液加入600μL的40%PEG6000;电击转化体系中,感受态细胞量200μL,质粒体积10μL,转化电压2.5kV。最高转化效率可达6823.67CFU/μg。【结论】建立了枯草芽孢杆菌菌株ZT4-2的电击转化体系,电击转化效率较高。

重组枯草芽孢杆菌的构建及对甾体的C_(1，2)位脱氢

本文将简单节杆茵3-甾酮-1-脱氢酶基因克隆到分泌表达载体pWB980上,并转入枯草芽孢杆菌WB600中,得到重组芽孢杆菌菌株。重组芽孢杆菌表达出的目的蛋白的分子量为55KDa,分光光度法检测到胞内和胞外可溶性部分的酶活分别为110±0．5mU和15±0．6mU每毫克蛋白,对甾体底物4-AD的转化率为45．3%,比出发茵简单节杆菌提高了将近10倍。

枯草芽孢杆菌lspA影响细菌型豆豉中四甲基吡嗪的合成研究

枯草芽孢杆菌是细菌型豆豉中主要的微生物,其代谢产物四甲基吡嗪(Tetramethylpyrazine,TTMP)为一种具有坚果香气的风味活性化合物。为探究枯草芽孢杆菌脂蛋白信号肽酶Ⅱ(LspA)对豆豉中TTMP含量的影响。本研究以枯草芽孢杆菌BJ3-2为研究对象,利用同源重组敲除载体,构建BJ3-2ΔlspA菌株,并检测其中α-乙酰乳酸合酶与α-乙酰乳酸脱羧酶基因的转录水平;在45℃,用BJ3-2ΔlspA发酵大豆72 h,定量检测吡嗪类化合物和乙偶姻。结果表明,相比BJ3-2,BJ3-2ΔlspA中α-乙酰乳酸脱羧酶基因的转录水平显著下调0.51倍;吡嗪类物质含量显著下降,TTMP和乙偶姻的含量分别降低了46.65%和14.42%。本文首次报道了lspA对TTMP合成的重要作用,为豆豉风味调控提供理论基础。

重组枯草芽孢杆菌表达的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶安全性研究

通过系统评估重组枯草芽孢杆菌表达D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的安全性,为D-阿洛酮糖-3-差向异构酶在食品中的应用提供科学依据。依据现行《食品添加剂新品种管理办法》的规定,对D-阿洛酮糖-3-差向异构酶开展卫生学检验(重金属、微生物)、毒理学试验(包括急性经口毒性试验、3项遗传毒性试验、90 d经口毒性试验和致畸试验)等。重金属和微生物均符合我国食品安全国家标准的规定。D-阿洛酮糖-3-差向异构酶急性经口毒性试验表明:该物质属实际无毒级;3项遗传毒性试验结果均为阴性;90 d经口毒性试验未观察到有害作用剂量为19.6 g/(kg·bw·d),致畸试验结果显示试验剂量下D-阿洛酮糖-3-差向异构酶对SD大鼠无致畸作用。3批次D-阿洛酮糖-3-差向异构酶样品中均未检出枯草芽孢杆菌活菌。D-阿洛酮糖-3-差向异构酶作为食品添加剂新品种对人体健康造成的潜在风险较低。

Bacillus subtilis fmbj与2-脱氧葡萄糖协同作用对Rhizopus stolonifer的生物防治效果

【目的】通过添加佐剂2-脱氧葡萄糖(2-DOG)的方法提高拮抗细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis fmbj)菌株的生防效果。【方法】分别在PDA平板和水蜜桃上测定2-DOG对拮抗菌B.subtilis fmbj和病原菌桃软腐病菌葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)生长的影响及B.subtilis fmbj与不同浓度2-DOG协同作用对R.stolonifer的防治效果。【结果】平板试验表明,2-DOG浓度仅为0.3 mg.mL-1时,可完全抑制R.stolonifer的生长;而2-DOG高达20 mg.mL-1,B.subtilis fmbj依然存活,表现出对2-DOG有较高的耐受性。桃上接种试验发现,单独使用浓度为3.9×108 CFU/mL B.subtilis fmbj时,桃果实发病率为30%;4 mg.mL-1 2-DOG单独使用时桃果实发病率为35%;而当4 mg.mL-1 2-DOG和3.9×107 CFU/mL B.subtilis fmbj配合使用时,可完全抑制果实的腐败。【结论】拮抗菌B.subtilis fmbj和2-DOG协同作用比单独使用对桃果实软腐病的防治效果明显,该研究结果为桃果实采后病害控制和保藏提供了有效的方法与途径。