内生枯草芽孢杆菌BS-2防治荔枝霜疫病及其生化机理

研究内生枯草芽孢杆菌BS-2(Bacillus subtilis)菌株对荔枝采后果实霜疫病的防治效果,及其对体内活性氧代谢(SOD、POD、CAT、MDA、超氧阴离子自由基的产生速率)和病程相关蛋白(β-1,3葡聚糖酶活性、几丁质酶活性)等的影响。结果表明,BS-2菌株对荔枝霜疫病具有较好的防治效果,接种处理后6d,其防治效果为37.83%;经内生细菌处理的荔枝果皮的β-1,3葡聚糖酶活性、几丁质酶活性、CAT和SOD酶活性均比病菌处理的高,而POD、PPO酶活性以及膜透性、MDA含量与超氧阴离子自由基的产生速率却比病菌处理的低。当接种后6d,经内生细菌处理的荔枝果皮的β-1,3葡聚糖酶活性、几丁质酶活性和SOD酶活性分别比病菌处理的高70.73%、30.76%和297.43%;而POD、PPO酶活性和超氧阴离子自由基的产生速率却分别比病菌处理的低15.11%、4.96%和28.95%。

内生拮抗枯草芽孢杆菌BS-2菌株的发酵条件

内生拮抗细菌BS 2菌株在以黄豆粉为原料的 3号培养基中生长速度快 ,发酵滤液对辣椒炭疽病菌的抑制作用强 ,菌液对辣椒果炭疽病的防效最好。培养基初始 pH值、培养时间、温度、通气量等对菌株生长及其抗菌物质的分泌有明显影响。结果表明 ,以黄豆粉培养基、初始 pH值 6 .7(灭菌后 )、2 8℃、培养 4 8h、并尽量增大培养通气量 ,为菌株的最佳发酵条件。

分泌表达柔嫩艾美耳球虫EtMIC2重组枯草芽孢杆菌的构建与抗体检测

鸡球虫病是一种严重危害养鸡业生产的流行性肠道寄生原虫病,可造成严重的经济损失。目前,应用抗球虫药是防治球虫病的主要手段,但随着抗药性和环境污染等问题的出现,抗球虫疫苗的研究成为防控球虫病的热点。柔嫩艾美耳球虫是鸡球虫病的主要病原,因此,研究旨在通过芽孢杆菌表达系统,构建能够分泌表达柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白2(Eimeria tenella isolate microneme protein 2,EtMIC2)重组枯草芽孢杆菌菌株,为研发新型鸡球虫疫苗奠定基础。首先,采用PCR及质谱分析方法鉴定食用性及饲用性菌株,然后从柔嫩艾美耳球虫基因组中扩增EtMIC2基因,通过无缝克隆技术将其克隆至pBE2-R质粒中,构建重组质粒pBE2-R-EtMIC2,并采用冰浴转化将重组质粒分别整合至两株枯草芽孢杆菌中,最后采用PCR、SDS-PAGE、Western blot进行鉴定。将重组菌株饲喂雏鸡,免疫7 d后初步检测抗体效价。结果表明:EtMIC2基因克隆成功,且成功整合于饲用性枯草芽孢杆菌基因组,目的蛋白正确表达,并分泌至胞外,将重组菌株饲喂给雏鸡后,血液中检测出EtMIC2抗体。研究成功构建了分泌表达柔嫩艾美耳球虫EtMIC2蛋白的重组枯草芽孢杆菌,且重组菌株能刺激动物产生抗体,可用于后续的抗球虫免疫保护性试验。

枯草芽孢杆菌DC-1产维生素K_(2)的发酵条件优化

为提高微生物发酵法生产维生素K_(2)的产量和多样性,对枯草芽孢杆菌DC-1的发酵条件进行优化。采用单因素试验对其发酵条件包括碳源、氮源和无机盐进行初步优化,通过Plackett-Burman(PB)试验筛选出对DC-1产维生素K_(2)具有显著性影响的因素,应用响应面Box-Behnken设计优化获得DC-1的最优发酵条件。结果表明,DC-1产维生素K_(2)的最优发酵条件为甘油添加量36.5 g/L、糖蜜添加量31.8 g/L、黄豆粉添加量32.5 g/L、KH2PO_(4)浓度0.3 g/100 mL、K_(2)HPO_(4)·3H_(2)O浓度0.8 g/100 mL、Mg SO_(4)·7H_(2)O浓度0.7 g/100 mL、Na Cl浓度0.5 g/100 mL。在该条件下,MK-7产量达到94.66 mg/L,比初始发酵条件提高了48.04%;同时菌株DC-1产维生素K_(2)的多样性增加,经液相色谱-质谱联用(liquid chromatograph mass spectrometer,LC-MS)鉴定能同时产5种MK同系物,分别为MK-2、MK-3、MK-4和MK-7,其中一个类似物未能在高分辨率质谱中找到,根据保留时间推测其为MK-5或MK-6,可为维生素K_(2)的工业化生产和探索维生素K_(2)同系物的生物活性奠定基础。

枯草芽孢杆菌262XY2′菌剂对番茄枯萎病的预防效果及其对相关抗性生化指标的影响

【目的】以番茄为供试作物,研究枯草芽孢杆菌262XY2′菌剂对番茄枯萎病的预防效果及其对番茄植株和根际土壤生化指标的影响,以期为菌剂在农业生产制备和生物安全应用中提供理论依据。【方法】设置不同固态菌剂添加量(分别占育苗基质质量的0.5%、1.0%、2.0%、3.0%和4.0%)的试验处理组与不添加固态菌剂的对照组(CK)进行番茄育苗,番茄四叶一心后移栽至花盆进行盆栽试验,定植6周后按照病情程度分级法测定供试菌剂对盆栽番茄枯萎病的预防效果;并测定番茄植株过氧化氢酶活性、过氧化物酶活性、超氧化物歧化酶活性、几丁质酶活性和总巯基含量以及番茄根际土壤游离氨基酸含量、过氧化氢酶活性、N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶活性和脲酶活性等生化指标。【结果】0.5%菌剂处理的番茄根际土壤中游离氨基酸含量比CK高44.325%,N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶活性比CK高108.848%,过氧化氢酶活性比CK高16.472%,均为最高值;1.0%菌剂处理对番茄枯萎病的预防效果最佳,为73.485%,1.0%菌剂处理的番茄植株过氧化氢酶活性比CK高55.742%,过氧化物酶活性比CK高47.404%,超氧化物歧化酶活性比CK高39.433%,几丁质酶活性比CK高209.989%、番茄根际土壤脲酶活性比CK高12.063%,均为最高值;总巯基含量则以2.0%菌剂处理最高,比CK高191.304%。【结论】总体上,0.5%、1.0%和2.0%菌剂处理均不同程度提高了番茄防御酶活性,改善了番茄根际土壤的生化性质,3.0%和4.0%菌剂处理对番茄及其根际土壤各项生化指标影响效果不明显,甚至产生抑制作用。

枯草芽孢杆菌Bs-916的抑菌活性及其抑菌物质初探

为了揭示从土壤中分离出的拮抗菌—枯草芽孢杆菌Bs-916的抑菌作用和抑菌机理,采用管蝶法、平板涂抹法及孢子盟发法测定了Bs-916及其代谢液对水稻纹枯病菌、蚕豆枯萎病菌等8种病原菌的抑菌活性,结果表明其对供试的大多数病原菌均具有较强的抑菌活性,如Bs-916及其代谢液对水稻纹枯病菌的抑制率分别为95.4%和70.7%,对水稻稻曲病菌的抑制率均为100%。为了探索Bs-916胞外物质的种类及特性,分别采用丙酮沉淀、PEG沉淀、等电点沉淀和超微浓缩等方法从Bs-916代谢液中获得了沉淀物或截留物,它们均具有抑菌活性。沉淀物经蛋白酶K处理后,活性减弱,说明Bs-916胞外抗菌物质具有蛋白质的性质。

多粘类芽孢杆菌BRF-1和枯草芽孢杆菌BRF-2对黄瓜和番茄枯萎病的防治效果

采用室内培养方法，对生防细菌多粘类芽孢杆菌BRF-1和枯草芽孢杆菌BRF-2不同稀释倍数的代谢产物抑制黄瓜尖孢镰刀菌、番茄枯萎病菌分生孢子萌发和菌丝生长的试验结果表明，当两菌株代谢产物稀释5倍时，对分生孢子萌发的抑制率达到80％以上；两菌株代谢产物在稀释2倍和5倍时，对2种病原真菌菌丝生长的抑制率在40％-80％之间，与对照差异极显著（P〈0．01）。盆栽试验表明，BRF-1和BRF-2生防细菌菌悬液及其无菌代谢物对黄瓜和番茄枯萎病不仅具有较好的防治效果，而且具有明显的促进生长作用。

枯草芽孢杆菌对Caco-2细胞抗氧化功能的影响研究

本试验旨在研究枯草芽孢杆菌对氧化应激状态下Caco-2细胞抗氧化功能的影响。将Caco-2细胞分为4组,对照Ⅰ(空白对照组,0μmol/L H2O2)和对照Ⅱ(氧化应激组,100μmol/L H2O2),处理Ⅰ和处理Ⅱ分别在对照Ⅱ条件下添加枯草芽孢杆菌B1和B10(终浓度为0.3×108CFU/mL),分别于12、48h测定氧化应激状态下Caco-2细胞上清液和裂解液的抗氧化活性。结果表明:与空白对照组和氧化应激组相比,添加2株枯草芽孢杆菌均极显著提高了Caco-2细胞培养上清液12、48 h时的总抗氧化能力(P<0.01)。其中,菌株B1可显著提高上清液中抗超氧阴离子(O2-)(P<0.01)、超氧化物歧化酶(SOD)(P<0.01)和过氧化氢酶(CAT)(P<0.01)以及48h的过氧化物酶(POD)活性(P<0.01),而菌株B10除提高了Caco-2细胞上清液中抗O2-、SOD和CAT活性(P<0.01)外,还提高了细胞抑制羟自由基(.OH)能力(P<0.01)和POD活性(P<0.01或P<0.05);添加枯草芽孢杆菌组细胞上清液中12 h时的乳酸脱氢酶(LDH)活性和丙二醛(MDA)含量与氧化应激组相比差异不显著(P>0.05),48 h时则均极显著降低(P<0.01)。细胞培养12 h时,氧化应激组细胞裂解液中SOD活性和GSH含量比空白对照组低(P<0.05)而POD活性高(P<0.01),48h时结果与之相反,此时添加枯草芽孢杆菌组均极显著提高了细胞裂解液中POD的活性(P<0.01)。结果提示,2株枯草芽孢杆菌均提高了氧化应激状态下细胞的抗氧化功能。

枯草芽孢杆菌Bs-916胞外抗菌蛋白质的生物功能分析

采用AKTA-epxlore层析系统,利用DEAE sepharose fast flow、Phenyl sepharose 6 F.F.和羟基磷石灰石柱层析后,分离纯化获得枯草芽孢杆菌Bs-916抗菌蛋白质Bacisubin。该蛋白质对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisease)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、白菜黑斑病菌(Alternaria oleracea)、甘蓝黑斑病菌(A.brassicae)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici(syd.)Butl.)和水稻恶苗病菌(Fusarium moniliformeSheld)均有抑菌活性,尤其对Alternaria属的病原菌具有较高的毒力。枯草芽孢杆菌Bs-916胞外抗菌蛋白质的抑菌机制是造成病原菌菌丝营养吸收困难,致使菌丝顶端膨大,分支增加,胞壁加厚、断裂,从而抑制了病原菌的生长。研究发现抗菌蛋白具有凝集素活性和核糖核酸酶活性,无蛋白酶活性和蛋白酶抑制活性。

高压CO_2处理对枯草芽孢杆菌芽孢杀灭及协同作用的影响

选用枯草芽孢杆菌为研究对象,以磷酸盐缓冲液为基质,研究高压(5～25MPa)CO2协同热处理对其芽孢杀灭作用的影响。结果表明:20MPa高压CO2处理前在45℃预热处理30min时枯草芽孢杆菌芽孢的失活率达到了3.84个数量级,单纯20MPa高压CO2处理30min时枯草芽孢杆菌芽孢的失活率达到2.44个数量级。采用连续式和间歇式两种不同的施压方式考查其对枯草芽孢杆菌芽孢的灭活及萌发影响,结果表明:10MPa、50℃连续30min高压CO2处理对枯草芽孢杆菌芽孢的杀灭使其数量下降了0.67个数量级,间歇施压(低压10MPa施压10min,高压30MPa施压10min)循环1次时枯草芽孢杆菌芽孢的失活率达到2.55个数量级。选择添加3种组合的营养发芽诱导因子考察在不同的压力条件下(10MPa 30℃、10MPa 50℃、30MPa 30℃、30MPa 50℃)与高压CO2处理相结合对芽孢发芽的影响。结果表明:添加的营养发芽诱导因子在低压(10MPa)时的诱导作用不如高压(30MPa)时明显。

枯草芽孢杆菌对Cu^(2+)的吸附及菌体表面基团分析

以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为生物吸附剂,讨论了其对Cu2+的生物吸附规律,并通过酸碱滴定这一表面分析手段,结合相关软件及傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析了菌体表面主要的基团种类及数量。结果表明,枯草芽孢杆菌对Cu2+吸附的最佳条件是:pH为6、吸附时间为24h,菌悬液用量和Cu2+初始浓度根据实际情况加以选择,以期达到最佳处理效果并兼顾经济成本;菌体对Cu2+的吸附过程较好地符合Langmuir吸附模型,在设定条件(室温(25℃)、溶液pH为6、吸附时间为24h、Cu2+初始质量浓度为34.52mg/L、菌悬液用量为1.5mL)下,Cu2+的饱和吸附量可达到17.056mg/g;菌体表面带有—COOH、C=O、—OH、—NH、—CONH—、P—O—C等基团,且在酸碱滴定操作过程中,没有掩蔽菌体表面的某种基团,也没有发生细胞溶解而导致基团种类增加;增强溶液酸性可导致菌体表面官能团的质子化效应增加,导致H+与Cu2+竞争官能团,这正是酸度较高不利于菌体与Cu2+结合的原因之一。

氮源对重组枯草芽孢杆菌24/pMX45核黄素发酵的影响

考察了无机氮源NH4 Cl和不同有机氮源对重组枯草芽孢杆菌 2 4 / pMX4 5核黄素发酵的影响 .实验结果表明 ,NH4 Cl作为基础氮源对菌体生长和核黄素合成均有抑制作用 .采用不同有机氮源进行核黄素发酵 ,以酵母粉为氮源时发酵单位最高 ,而蛋白胨为氮源时核黄素发酵单位最低 .

枯草芽孢杆菌B_2发酵工艺及其质量检测方法研究

研究了枯草芽孢杆菌B2从种子发酵液到发酵罐的放大培养,通过正交优化试验筛选枯草芽孢杆菌B2发酵的优化组合、种子罐和发酵罐的发酵时间及发酵液的质量检测方法.结果表明:枯草芽孢杆菌B2的最佳发酵组合为接种量10%,pH 7.5,通气量1 000 L.h-1,转速200 r.min-1;种子罐的发酵时间为20 h;发酵罐最适放罐时间为36 h.发酵液质量检测以活菌量为主要指标,辅助比浊法检测.

枯草芽孢杆菌拮抗病原菌黏附和入侵Caco-2细胞的研究

为探讨枯草芽孢杆菌及其培养上清液对产肠毒素大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的抗黏附作用,本试验将产肠毒素大肠杆菌K88或鼠伤寒沙门氏菌SL1344与枯草芽孢杆菌及其培养上清液先后加到Caco-2细胞上,用活菌计数的方法观察产肠毒素大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌及枯草芽孢杆菌黏附Caco-2细胞的情况。结果显示:在排斥、竞争和置换试验中,枯草芽孢杆菌菌体均能够明显抑制K88和SL1344的黏附及SL1344的内化,在竞争试验时K88的黏附减少了71.2%、SL1344的黏附及内化减少了92.9%,但枯草芽孢杆菌的培养上清液只有在竞争试验中才能明显抑制K88和SL1344的黏附及SL1344内化。提示:枯草芽孢杆菌通过与病原菌竞争黏附位点来抑制病原菌对Caco-2细胞的黏附和入侵。

枯草芽孢杆菌BSD-2诱导黄瓜抗灰霉病的作用研究

以枯草芽孢杆菌BSD-2为供试菌,黄瓜品种"津春4号"为试材,采用生理生化方法,研究了BSD-2发酵液、抗菌肽及芽孢稀释溶液对叶片过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响;采用电泳法测定POD同工酶和叶片胞间隙蛋白质的变化。结果表明:处理后的酶活均在第5天达到高峰,发酵液处理对酶活性的提高作用明显。POD同工酶的变化不仅表现在同种同工酶表达量的改变,同工酶种类也相应地增加,叶片胞间隙蛋白电泳中出现大小约为27kDa的新增蛋白条带,并且发酵液处理第11天时新增蛋白出现表达量的积累。表明枯草芽孢杆菌BSD-2及其抗菌物质可以通过提高防御酶活性,促进POD同工酶和胞间隙相关蛋白质的表达,从而诱导黄瓜产生对灰霉病的抗性作用。

枯草芽孢杆菌B_2种子液发酵条件的研究

采用单因子、双因子及正交试验,对枯草芽孢杆菌B2的培养液组成(碳源、氮源、酵母膏、pH值)及培养条件(装液量与转速)进行了研究,结果表明:以葡萄糖1%,牛肉胨0.8%,酵母膏0.5%及pH 8制成的培养液,装液量100 mL/250 mL锥形瓶,转速140 r/min,培养B236 h为最佳培养条件,在此条件下,活菌数可达2.97×1010cfu/mL,分别是D培养液和NB培养液的2.05倍和52.36倍.

枯草芽孢杆菌产3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇发酵条件优化

研究以一株从古井窖泥中分离筛选的枯草芽孢杆菌为出发菌株,进行发酵培养成分和发酵条件优化。与静置发酵相比,振荡培养可有效提高菌株发酵液中3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇的产量;在振荡培养的基础上采用正交试验方法对发酵培养基和培养条件进行了优化。实验结果表明,枯草芽孢杆菌发酵培养的最佳条件为:3mmol/L Mg^(2+),15g/L蛋白胨,150r/min,32℃。与初始静置发酵条件相比,最优条件下3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇(左旋)、2,3-丁二醇(内消旋)的产量分别提高了57.75%、1234.96%、163.33%。

超临界CO_2诱变枯草芽孢杆菌的研究

采用超临界CO2诱变淀粉酶产生菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),提高其产淀粉酶的活力。结合平板初筛与发酵培养测定酶活力复筛的方法,考察了诱变条件如诱变压力、诱变温度和诱变时间对诱变该菌的影响。其最佳诱变条件为:压力8.0 MPa、温度37℃、时间30 min,在此条件下,诱变株的淀粉酶活力提高了约33%。

高压CO_2对枯草芽孢杆菌杀菌模型及其优化

以枯草芽孢杆菌为主要研究对象,杀灭对数值为衡量高压CO2杀菌效果的指标。在单因素实验基础上,选取压力、温度和保压时间为自变量,杀灭对数值为响应值。通过响应面方法中的Box-Behnken模式,研究各自变量及其交互作用对杀灭对数值的影响,模拟得到二次多项式回归方程的预测模型。确定最佳条件为压力30MPa,温度48℃,时间90min,实际测得的枯草芽孢杆菌杀灭对数值为5.22,与模型预测值5.44相比,实验平均相对误差为2.32%;采用响应曲面优化法建立的回归模型准确可行,优化得到的工艺参数可以应用。

枯草芽孢杆菌突变株BS-9发酵D-核糖条件研究

以枯草芽孢杆菌为出发菌株，经紫外线诱变处理，选育出莽草酸营养缺陷型突变株ＢＳ－９，其发酵产物经物理、化学鉴定为Ｄ－核糖．通过利用碳源、氮源实验，发现该突变株在以葡萄糖为碳源、玉米浆和硫酸铵为氮源的发酵培养基中生长良好，在温度为３６℃，ｐＨ值为６．８，转速为２３０ｒ·ｍｉｎ－１中摇床培养７２ｈ，Ｄ－核糖质量浓度可高达６７．６ｇ·Ｌ－１。