枯草芽孢杆菌Bs-916胞外抗菌蛋白质的生物功能分析

采用AKTA-epxlore层析系统,利用DEAE sepharose fast flow、Phenyl sepharose 6 F.F.和羟基磷石灰石柱层析后,分离纯化获得枯草芽孢杆菌Bs-916抗菌蛋白质Bacisubin。该蛋白质对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisease)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、白菜黑斑病菌(Alternaria oleracea)、甘蓝黑斑病菌(A.brassicae)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici(syd.)Butl.)和水稻恶苗病菌(Fusarium moniliformeSheld)均有抑菌活性,尤其对Alternaria属的病原菌具有较高的毒力。枯草芽孢杆菌Bs-916胞外抗菌蛋白质的抑菌机制是造成病原菌菌丝营养吸收困难,致使菌丝顶端膨大,分支增加,胞壁加厚、断裂,从而抑制了病原菌的生长。研究发现抗菌蛋白具有凝集素活性和核糖核酸酶活性,无蛋白酶活性和蛋白酶抑制活性。

枯草芽孢杆菌Bs-916的抑菌活性及其抑菌物质初探

为了揭示从土壤中分离出的拮抗菌—枯草芽孢杆菌Bs-916的抑菌作用和抑菌机理,采用管蝶法、平板涂抹法及孢子盟发法测定了Bs-916及其代谢液对水稻纹枯病菌、蚕豆枯萎病菌等8种病原菌的抑菌活性,结果表明其对供试的大多数病原菌均具有较强的抑菌活性,如Bs-916及其代谢液对水稻纹枯病菌的抑制率分别为95.4%和70.7%,对水稻稻曲病菌的抑制率均为100%。为了探索Bs-916胞外物质的种类及特性,分别采用丙酮沉淀、PEG沉淀、等电点沉淀和超微浓缩等方法从Bs-916代谢液中获得了沉淀物或截留物,它们均具有抑菌活性。沉淀物经蛋白酶K处理后,活性减弱,说明Bs-916胞外抗菌物质具有蛋白质的性质。

内生拮抗枯草芽孢杆菌BS-2菌株的发酵条件

内生拮抗细菌BS 2菌株在以黄豆粉为原料的 3号培养基中生长速度快 ,发酵滤液对辣椒炭疽病菌的抑制作用强 ,菌液对辣椒果炭疽病的防效最好。培养基初始 pH值、培养时间、温度、通气量等对菌株生长及其抗菌物质的分泌有明显影响。结果表明 ,以黄豆粉培养基、初始 pH值 6 .7(灭菌后 )、2 8℃、培养 4 8h、并尽量增大培养通气量 ,为菌株的最佳发酵条件。

枯草芽孢杆菌Bs916防治番茄青枯病

采用室内MS平板植物组培法、温室盆栽试验和微生物特异性平板分离检测技术,评估了枯草芽孢杆菌Bs916对番茄的促生、防治青枯病的作用,研究了菌株Bs916对番茄根表及茎内青枯菌种群数量的影响和对番茄根围可培养微生物含量的影响。在植物组培MS平板中,枯草芽孢杆菌Bs916对番茄植株鲜重具有促生作用,播种15 d后,其鲜重达79.8 mg,比未处理对照增加9.61%。盆栽试验显示,枯草芽孢杆菌Bs916灌根处理番茄后14 d,对番茄青枯病的防治效果达55.6%;菌株Bs916处理番茄后,番茄根表、茎内青枯菌含量和未处理对照的青枯菌含量变化趋势一致,均呈现随着时间的改变而逐渐下降的趋势,菌株Bs916处理的根表青枯菌含量约为未处理对照的1/100~1/10,而茎内青枯菌含量为未处理对照的1/50~1/2。此外,菌株Bs916的施用对番茄根围土壤中细菌种群具有先抑制后促进的作用,对真菌具有先促进后快速抑制的作用,而对根围放线菌则无显著性影响。以上结果表明,芽孢杆菌Bs916具有潜在的防治番茄青枯病的田间应用前景,也为其田间应用提供了理论基础。

枯草芽孢杆菌B-916胞外抗菌蛋白质的性质

用硫酸铵分级沉淀枯草芽孢杆菌B-916胞外抗菌蛋白质,共获得8个蛋白质粗提物,其中硫酸铵饱和度为40%～50%和50%～60%提取的粗蛋白质具有较强的抑菌活性,研究结果表明:硫酸铵饱和度40%～50%和50%～60%提取的粗蛋白质浓度分别为17.261 μg/ml和18.899 μg/ml,上述两者对水稻纹枯病菌和水稻恶苗病菌有较强的抑菌活性,对马铃薯晚疫病菌则没有抑菌活性;当温度高于40 ℃时抑菌活性均降低,但在120 ℃时仍有部分抑菌活性;对pH值适应范围较宽,但在pH值为13.6时抑菌活性均丧失;经蛋白酶K、蛋白酶E、胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶处理后,抑菌活性均下降.SDS-PAGE电泳结果表明枯草芽孢杆菌B-916能分泌多种蛋白质,其中硫酸铵饱和度40%～50%和50%～60%提取的粗蛋白质中相对分子质量为 48 000的蛋白质可能为抗菌蛋白质.硫酸铵饱和度40%～50%和50%～60%提取的粗蛋白质经Sephadex G-100层析后检测到4个蛋白质吸收峰.

枯草芽孢杆菌Bs916在番茄根部的定殖

为了明确生防枯草芽孢杆菌Bs916在番茄根部的定殖能力,本研究基于Bs916全基因组数据,分析了Bs916中参与生物膜形成的关键编码基因簇,研究了Bs916及其绿色荧光蛋白(GFP)标记菌株Bs916G抑制番茄青枯菌的能力和生物膜形成能力,并采用植物MS平板定殖研究法和温室盆栽试验评估了Bs916在番茄根部的定殖能力和规律。全基因组分析结果表明,枯草芽孢杆菌Bs916拥有完整的生物膜形成关键基因(簇),包括胞外多糖(EPS)合成酶编码基因簇、Tas A蛋白和γ-多聚谷氨酸聚合酶编码基因簇,其大小分别为15 715 bp、786 bp和4 369bp,与已报道的相关氨基酸序列同源性达96%~100%。室内试验显示,GFP标记菌株Bs916G具有和野生菌株相同的抑制番茄青枯菌的能力和生物膜形成能力。在MS平板试验中,Bs916在番茄根部的定殖量可达3.1×107CFU/g。盆栽试验结果显示,在常规土壤或接种青枯菌处理中,Bs916在番茄根部的定殖数量都呈现先下降后上升,最后趋于稳定的趋势。表明,枯草芽孢杆菌Bs916可以在番茄根部有效定殖,这为其在田间防治番茄青枯病提供重要保障。

离子注入选育枯草芽孢杆菌生防菌B-916高效菌种

为进一步提高枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis)生防菌B 916的生长速度和拮抗性能 ,获得生防效果更好的高效菌种 ,利用不同剂量N+ 对生防菌B 916 ,进行离子注入处理。结果表明 :采用剂量为 1cm2 90× 2 6× 10 13 N+诱变生防菌B 916 ,其存活率最高 ;从诱变效果看 ,离子注入生防菌B 916的最适剂量为 1cm2 15 0× 2 6× 10 13 N+ ～2 5 0× 2 6× 10 13 N+ ;生防菌B 916经离子注入获得的突变菌株再次进行离子注入 ,其存活率和诱变效果可明显提高。本研究获得了 13个拮抗能力比生防菌B 916提高 10

内生枯草芽孢杆菌BS-2防治荔枝霜疫病及其生化机理

研究内生枯草芽孢杆菌BS-2(Bacillus subtilis)菌株对荔枝采后果实霜疫病的防治效果,及其对体内活性氧代谢(SOD、POD、CAT、MDA、超氧阴离子自由基的产生速率)和病程相关蛋白(β-1,3葡聚糖酶活性、几丁质酶活性)等的影响。结果表明,BS-2菌株对荔枝霜疫病具有较好的防治效果,接种处理后6d,其防治效果为37.83%;经内生细菌处理的荔枝果皮的β-1,3葡聚糖酶活性、几丁质酶活性、CAT和SOD酶活性均比病菌处理的高,而POD、PPO酶活性以及膜透性、MDA含量与超氧阴离子自由基的产生速率却比病菌处理的低。当接种后6d,经内生细菌处理的荔枝果皮的β-1,3葡聚糖酶活性、几丁质酶活性和SOD酶活性分别比病菌处理的高70.73%、30.76%和297.43%;而POD、PPO酶活性和超氧阴离子自由基的产生速率却分别比病菌处理的低15.11%、4.96%和28.95%。

枯草芽孢杆菌突变株BS-9发酵D-核糖条件研究

以枯草芽孢杆菌为出发菌株，经紫外线诱变处理，选育出莽草酸营养缺陷型突变株ＢＳ－９，其发酵产物经物理、化学鉴定为Ｄ－核糖．通过利用碳源、氮源实验，发现该突变株在以葡萄糖为碳源、玉米浆和硫酸铵为氮源的发酵培养基中生长良好，在温度为３６℃，ｐＨ值为６．８，转速为２３０ｒ·ｍｉｎ－１中摇床培养７２ｈ，Ｄ－核糖质量浓度可高达６７．６ｇ·Ｌ－１。

FliZ调控枯草芽孢杆菌Bs916生物膜形成及其对水稻纹枯病的防治效果

【目的】发掘并鉴定枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bs916生物膜形成调控新基因,检测其对Bs916生物膜形成能力和对水稻纹枯病防治效果的影响。【方法】利用基因同源重组技术构建fliZ基因位点的单敲除突变株,通过干重分析法来验证其生物膜形成的缺陷;利用平板对峙试验检测fliZ突变株和Bs916对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)的抑菌效果;利用高效液相色谱(HPLC)检测fliZ突变株和Bs916中影响防治效果的3种脂肽类抗生素表面活性素、杆菌霉素L和泛革素的相对产量;利用绿色荧光标记技术构建Bs916与fliZ突变株的GFP标记菌株,观察两者在水稻茎秆定殖能力变化;检测fliZ突变株和Bs916对水稻纹枯病的防治效果。【结果】成功构建了fliZ位点单敲除突变株,与对照组Bs916的三维立体结构生物膜相比仅能形成平面二维结构生物膜,呈现破碎状态,证明其生物膜形成存在显著缺陷;对生物膜干重进行定量分析发现fliZ突变株生物膜干重仅为对照组Bs916的23%,进一步验证了fliZ突变株生物膜形成能力显著下降;游动性试验发现fliZ突变株菌体扩展直径仅为Bs916的32%,证明fliZ突变株的游动能力显著下降;抑菌试验显示两者抑菌带宽基本一致,证明fliZ突变株对水稻纹枯病菌的抑菌能力与Bs916相比无显著差异;成功检测了fliZ突变株和Bs916合成的3种脂肽类抗生素表面活性素、杆菌霉素L和泛革素的相对产量,fliZ突变株中杆菌霉素L相对产量显著增加1倍,而表面活性素和泛革素相对产量与Bs916相比无显著差异;水稻茎秆定殖试验发现fliZ突变株菌体数量显著低于Bs916,在水稻纹枯病病斑附近不出现显著的聚集效应,呈现无序分布状态,证明fliZ突变株与Bs916相比在水稻茎秆上的定殖能力显著下降;对水稻纹枯病的田间防治效果试验显示,fliZ突变株第6-15天防治效果介于6.0%-20.7%,显著低于Bs916的36.0%-57.6%,证明fliZ突变株对水稻纹枯病防治效果显著下降。【结论】鉴定的Bs916生物膜新调控基因fliZ位于控制鞭毛运动的信号通路,直接作用于菌体的游动与扩张,显著单一调控生物膜形成与对水稻纹枯病的防治效果。

辣椒内生细菌BS-1和BS-2在植物体内的定殖及鉴定

以抗利福平为标记 ,用浸种、涂叶和灌根方法接种 ,测定菌株在植物体内的定殖。结果表明 ,来自辣椒体内的BS_2和BS_1菌株不仅可在辣椒体内定殖 ,也可在番茄、茄子、黄瓜、甜瓜、西瓜、丝瓜、小白菜等植物体内定殖 ,BS_2菌株还可在水稻、小麦及豇豆等植物体内定殖 ,BS_2菌株的内生定殖宿主范围比BS_1菌株的广 ;另外BS_2菌株可在辣椒和白菜体内较长期定殖。用常规方法、Biolog及 1 6SrRNA序列比较 ,两菌株鉴定为枯草芽杆菌内生亚种 (Bacillussubtilissubsp .endophyticus)。

内生菌BS-2菌株的抗菌蛋白及其防病作用

BS 2菌株为一株能在多种植物体内定殖 ,对多种植物炭疽病具有良好防治效果 ,并对植物生长具有良好促进作用的枯草芽孢杆菌 ,其BPY培养液经 30 %～ 70 %硫酸铵盐析、高温 (10 0℃ )处理后 ,以SDS PAGE、MALDI TOF检测 ,该菌株分泌的抗菌蛋白为分子量≤ 2 884 .39D的多肽 ;该抗菌多肽对热稳定并抗紫外线照射 ,对植物炭疽病菌和番茄青枯病菌等多种植物病原真菌和细菌有强烈的抑制作用 ,并对辣椒果炭疽病具有 6 9.79% (9d后 )的防病效果 ;抑制病菌生长 ,引起菌丝 (或芽管 )细胞消融 ,导致菌丝畸形以及抑制病菌分生孢子的产生和萌发等可能是该抗菌多肽主要的防病机制。

生物表面活性剂产生菌的生长动力学研究及营养优化

[目的]对产生物表面活性剂菌种BS-2的生长动力进行研究并对其发酵的营养条件进行优化。[方法]运用Monad、Haldane和Teissier模型对BS-2的生长动力学进行探讨,分别在不同单因素限制条件下对初始营养条件进行优化,并对初始营养中的碳源与氮源的质量比进行优化。[结果]表面活性剂产生菌BS-2在单因素营养条件受限时,菌体的最大生长量分别出现在碳源初始浓度为60g/L和氮源初始浓度为4g/L时,此时的特征生长率分别为0.0912h-1和0.092h-1,Teissier模型的回归参数与实际值最为接近,在碳源和氮源受限时的最大生长速率umax分别为0.0903h-1和0.0924h-1;而在保持相同的碳源初始浓度时,培养液的最小表面张力与菌体生长量分别出现在C/N=10和15时。[结论]BS-2对氮源比对碳源有更好的亲和性,C/N比能够较好地调节表面活性剂产生菌在增加自身生长量和产表面活性剂2种生长功能之间的平衡。

食用菌污染菌脉孢菌的生物防治

通过对峙培养、发酵液的抑菌试验,发现枯草芽孢杆菌BS-2对好食脉孢菌Neurospora sitophila有较强的抑制作用,BS-2能显著地抑制脉孢菌菌丝生长及其孢子萌发,但对食用菌抑制作用相对较弱。BS-2主要的抑菌物质可能是其分泌的多种抗菌蛋白质,BS-2的抑菌能力可通过脉孢菌代谢产物的诱导而加强。