10种农业化学品对柑橘内生菌枯草芽孢杆菌L1-21的影响

【目的】明确农业化学品对柑橘内生菌的影响,指导柑橘合理用药。【方法】采用平板菌落计数法,测定了6种杀虫剂、3种杀菌剂和微肥EDTA-Cu对生防菌株枯草芽孢杆菌L1-21的相容性及对柑橘植株内生菌的抑制作用。【结果】56.00 mg·L^(-1)吡虫啉、121.80 mg·L^(-1)虫螨腈、4.00 mg·L^(-1)甲氨基阿维菌素、50.00 mg·L^(-1)噻虫嗪、45.60 mg·L^(-1)氟氯氰菊酯、800.00 mg·L^(-1)辛硫磷、402.00 mg·L^(-1)喹啉铜、3728.00 mg·L^(-1)硫磺、620.60 mg·L^(-1)氧化亚铜和321.00 mg·L^(-1)EDTA-Cu在平板上对L1-21的抑制率均达100.00%。2倍剂量处理离体叶片24 h后,除8.00 mg·L^(-1)甲氨基阿维菌素的抑制率(16.84%)显著低于其他5种杀虫剂外,其他5种杀虫剂对L1-21的抑制率均无显著差异。2倍剂量处理柑橘活体叶片24 h后,8.00 mg·L^(-1)甲氨基阿维菌素对柑橘叶片内的L1-21抑制作用(4.23%)不明显,显著低于其他5种杀虫剂和3种杀菌剂与微肥EDTACu;对内生菌总量的抑制率以8.00 mg·L^(-1)甲氨基阿维菌素(6.78%)最低,其他制品达46.90%~70.06%,且差异未达显著水平。【结论】10种农业化学品在平板上均可抑制L1-21,抑制率的大小与其浓度有关。2倍田间登记使用量处理时,10种农业化学品均可影响L1-21在柑橘叶片上的定殖及降低柑橘内生细菌总量。因此,田间施用化学品对柑橘内生菌的负面影响不可忽视。

枯草芽孢杆菌LTA诱导绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1表达的影响研究

为探究枯草芽孢杆菌的脂磷壁酸(LTA)对绵羊瘤胃上皮细胞(ORECs)中绵羊β-防御素-1(SBD-1)表达的影响,本试验使用不同浓度(0、10、20、30、40和50μg/mL)的枯草芽孢杆菌LTA刺激ORECs 8 h,并通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和荧光定量PCR试验(qPCR)分别检测ORECs SBD-1蛋白和mRNA的表达量,确定最佳刺激浓度;再用最佳刺激浓度的枯草芽孢杆菌LTA分别刺激ORECs不同时间(0、2、4、8、12和24 h),采用qPCR和ELISA方法检测SBD-1的mRNA和蛋白表达量,确定最佳刺激时间。结果表明:不同条件下的枯草芽孢杆菌LTA均可使ORECs中SBD-1的表达量上调,其中在刺激浓度为10μg/mL与刺激时间为8 h的情况下,SBD-1的表达量最高,且与对照组呈极显著差异(P<0.01);并且不同条件下的枯草芽孢杆菌LTA对ORECs的刺激均不产生细胞毒性作用。这说明枯草芽孢杆菌LTA可诱导ORECs中SBD-1表达量增加,且最佳诱导浓度和时间分别为10μg/mL和8 h。本研究为枯草芽孢杆菌LTA诱导调节SBD-1机制的研究提供理论依据。

枯草芽孢杆菌细胞壁通过TLR-2-MyD88-NF-κB/MAPK信号通路调控绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1的表达

为了探索枯草芽孢杆菌细胞壁诱导绵羊β-防御素-1(SBD-1)表达的主要信号转导途径,本试验首先使用反复冻融法与超声波破碎法相结合的方法破碎枯草芽孢杆菌并收集其细胞壁,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测方法分析细胞壁成分及其含量,然后利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)方法检测枯草芽孢杆菌细胞壁刺激绵羊瘤胃上皮细胞(ORECs)后通路因子(TLR-2、MyD88、NF-κB、p38、JNK和ERK1/2)mRNA和蛋白的表达变化,最后使用通路抑制剂分别阻断NF-κB、p38、JNK和ERK1/2信号通路,用枯草芽孢杆菌细胞壁刺激ORECs并检测刺激后SBD-1 mRNA表达变化,从而确定诱导SBD-1表达的主要信号通路。结果显示,枯草芽孢杆菌细胞壁制备成功,细胞壁主要成分为肽聚糖和磷壁酸,含量分别为(90.85±0.91)%和(8.85±0.11)%。与对照组相比,枯草芽孢杆菌细胞壁刺激ORECs后信号通路因子(TLR-2、MyD88、NF-κB、p38、JNK和ERK1/2)的mRNA和蛋白的表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01),使用通路抑制剂阻断各个信号通路后再刺激ORECs,SBD-1 mRNA表达水平均极显著下降(P<0.01),且添加NF-κB和JNK抑制剂组下降幅度最大。结果表明,枯草芽孢杆菌细胞壁可能通过TLR-2-MyD88-NF-κB/MAPK信号通路调控ORECs SBD-1的表达。

枯草芽孢杆菌肽聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(SBD-1)表达的影响

为了探究来源于枯草芽孢杆菌细胞壁的肽聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞(ORECs)中β-防御素-1(SBD-1)表达的影响,本试验使用30μg/mL肽聚糖刺激ORECs不同时间(2、4、6、8、10和12 h),采用荧光定量PCR(qPCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)方法分别检测SBD-1的mRNA和蛋白表达量,确定最佳刺激时间;再使用不同浓度的肽聚糖(0、10、20、30、40和50μg/mL)刺激ORECs 2 h,采用qPCR和ELISA方法检测SBD-1的mRNA和蛋白表达量,确定最佳刺激浓度。结果显示:(1)使用30μg/mL肽聚糖刺激ORECs不同时间时,SBD-1的mRNA和蛋白表达量随着时间的增加呈先下降后升高的趋势,2 h时表达量最多并极显著高于对照组(P<0.001)。(2)使用不同浓度肽聚糖刺激ORECs 2 h时,SBD-1的mRNA和蛋白表达量随着肽聚糖浓度的升高呈现先升高后降低的趋势,在20μg/mL时表达量最多并极显著高于对照组(P<0.001)。(3)不同时间刺激试验和不同浓度刺激试验均不会对ORECs产生细胞毒性作用。结果表明,来源于枯草芽孢杆菌的肽聚糖能够诱导ORECs表达SBD-1,最佳刺激条件为20μg/mL枯草芽孢杆菌肽聚糖刺激ORECs 2 h。

枯草芽孢杆菌培养上清液对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1表达的影响

[目的]探究枯草芽孢杆菌培养上清液对绵羊瘤胃上皮细胞(ovine ruminal epithelial cells,ORECs)中绵羊β-防御素-1(sheepβ-defesin-1,SBD-1)表达的影响。[方法]采用Cell Counting kit-8(CCK-8)方法筛选对ORECs无明显毒性作用的枯草芽孢杆菌培养上清液刺激浓度范围与刺激时间范围。用筛选出的无明显毒性作用的不同浓度枯草芽孢杆菌对应的培养上清液刺激ORECs 8 h后,采用荧光定量PCR(qPCR)技术和酶联免疫吸附(ELISA)检测方法筛选枯草芽孢杆菌培养上清液诱导SBD-1表达的最佳刺激浓度,以该浓度枯草芽孢杆菌对应的培养上清液刺激ORECs不同时间,采用qPCR技术和ELISA检测方法确定枯草芽孢杆菌培养上清液诱导SBD-1表达的最佳刺激时间。[结果]①对ORECs无明显毒性作用的枯草芽孢杆菌对应的培养上清液浓度范围为10^(7)~10^(11) CFU/mL,刺激时间范围为2~24 h。②利用qPCR技术和ELISA检测方法筛选出最佳刺激浓度为10^(11) CFU/mL枯草芽孢杆菌对应的培养上清液。③以该浓度枯草芽孢杆菌对应的培养上清液刺激ORECs不同时间,采用qPCR技术和ELISA检测方法确定枯草芽孢杆菌培养上清液诱导SBD-1表达的最佳刺激时间为24 h。[结论]枯草芽孢杆菌培养上清液可以诱导ORECs SBD-1的表达。

枯草芽孢杆菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1表达的影响

选用益生枯草芽孢杆菌研究其对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素表达的调节作用。首先,在体外成功培养绵羊瘤胃上皮细胞,然后用枯草芽孢杆菌对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞进行不同浓度、不同时间的刺激,利用荧光定量PCR技术(Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-PCR)从mRNA水平检测刺激后上皮细胞中绵羊β-防御素-1(Sheep beta-defensin-1,SBD-1)基因表达水平的差异。结果表明:当菌液浓度为1010 cfu·mL-1刺激上皮细胞8h后,SBD-1的表达量达到最高;不同的菌液浓度诱导下SBD-1的表达量均有显著增加,109、1010、1011 cfu·mL-1菌液浓度刺激下,SBD-1的表达量与空白相比差异极显著(P<0.01)。结果表明,枯草芽孢杆菌能够诱导绵羊瘤胃上皮细胞内SBD-1基因的表达。

海洋多粘类芽孢杆菌L_1-9菌株发酵液抗菌谱及稳定性测定

采用琼脂扩散法测定海洋多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)L1-9菌株发酵液的抗菌谱及抗菌作用的稳定性。结果表明:L1-9菌株发酵液对17种供试植物病原真菌均具有较强的的抑制作用,对5种病原真菌的抑菌带宽度达到15 mm以上;对供试5种病原细菌也具有明显的抑制作用;该菌株发酵液的抑菌作用具有较好的热稳定性和蛋白酶稳定性,在弱酸条件下抗菌作用较好,但对紫外线敏感。L1-9菌株的代谢产物具有广谱抗菌活性和较好的稳定性。

海洋多黏类芽孢杆菌L_1-9菌株抗菌蛋白的分离纯化及其抗菌作用

通过硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow柱层析、Sephadex G-200柱层析,以小麦蠕孢病菌和金黄色葡萄球菌为指示菌采用抑菌活性追踪和SDS-PAGE跟踪检测,从分离自连云港海域、对多种病原真菌具有抑菌作用的多黏类芽孢杆菌L1-9菌株发酵液中分离纯化得到一种对金黄色葡萄球菌和小麦蠕孢病菌的菌丝生长及孢子萌发具有抑制作用的抗菌蛋白,分子质量约31kD。

多粘类芽孢杆菌L_1-9菌株对番茄早疫病的抑菌防病作用

L1-9菌株是从连云港海域海泥中分离获得的1株多粘类芽孢杆菌。采用平板对峙法和打孔法测定L1-9菌株及其发酵液和无菌发酵液对番茄早疫病菌的抑制作用,结果表明:L1-9菌株和无菌发酵液对番茄早疫病菌菌丝生长有明显的抑制作用,培养4d的抑菌带宽度分别达到17.6mm和15.8mm,L1-9菌株的发酵液和无菌发酵液能明显降低早疫病菌的孢子萌发率并抑制芽管的伸长,发酵液的抑制作用高于无菌发酵液。采用离体叶片法和盆栽法测定该菌株的室内防病效果,结果表明:L1-9菌株的发酵液和无菌发酵液对番茄早疫病具有较好的防治效果,发酵液的防病效果高于无菌发酵液,其离体叶片法的保护效果和治疗效果分别达到79.28%和67.20%。

紫外诱变枯草芽孢杆菌选育葡萄糖-1-磷酸高产菌株

对出发菌株进行紫外诱变以获得葡萄糖-1-磷酸产量高且遗传稳定性好的枯草芽孢杆菌菌株。以葡萄糖-1-磷酸的发酵产量为考察指标,采用HPLC-MS检测方法,对出发菌株Bacillus sublitis XH-13进行三轮紫外诱变,并对获得的高产菌株连续传代6次。结果表明,枯草芽孢杆菌突变菌株UV3-8的葡萄糖-1-磷酸产量最高,达到6.85 g/L,是出发菌株产量的1.54倍,且遗传稳定性好。菌株Bacillussubtilis XH-13_UV3-8的营养简单、葡萄糖-1-磷酸产量高且遗传稳定性好,具有产业化应用前景。

应用比色法检测枯草芽孢杆菌变异菌株中1-脱氧野尻霉素含量

为寻找测定枯草芽孢杆菌黑色变种突变株Bacillus subtilis var.niger-231(B-231)的发酵液中1-脱氧野尻霉素(1-Deoxynojirimycin,DNJ)的新方法并提高其产发酵液中DNJ的含量。在有铜离子的存在下,DNJ与二硫化碳反应,用有机溶剂对产物萃取后在440 nm进行光度测定,得到DNJ含量。再采用紫外诱变方法处理突变株B-231。绘制了检测DNJ标准品的标准曲线,对测定DNJ的新方法做了精密度、灵敏度、准确度以及产物的稳定性的探讨,设计正交试验优化了反应条件,并将此方法运用到细菌发酵液中DNJ含量的测定中,通过遗传诱变手段处理原始细菌B-231,最终筛选到一株高产DNJ的菌株,命名为B.subtilis var.niger-431(B-431),DNJ含量达87.3 mg/L,其产生DNJ的量较原始菌株原突变株提高了4.2倍。首次提出了一种快速测定细菌发酵液中的1-脱氧野尻霉素的新方法,紫外诱变手段使细菌产生DNJ的能力有较大提高。

枯草芽孢杆菌BI1-1产抗白念珠菌物质培养条件的优化

目的对发酵产抗白念珠菌物质的培养基及培养条件进行优化,使抗菌物质的产量得到提高。方法以基本培养基为基础,利用单因素实验,确定碳氮源。采用Plackett-Burman设计对培养条件中相关影响因素的效应进行评价并筛选出重要的影响因素。然后用Box-Behnken设计及响应面分析确定了重要影响因素的最佳条件。结果优化后的碳源为蔗糖4%,氮源为硫酸铵0.5%,发酵条件为pH值7.53,温度30.48℃,培养时间64.4h。结论优化后的抗菌抑菌圈直径达到40.00mm,比优化前的18.25mm提高了119.2%。

海洋多粘类芽孢杆菌L_1-9菌株对黄瓜的促生作用和诱导抗性研究

以黄瓜种子为试材,采用盆栽法研究了L1-9菌株发酵液浸泡黄瓜种子后,对黄瓜幼苗的根长、须根数、黄瓜枯萎病发生的影响,并测定了黄瓜根组织的过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)和多酚氧化酶(PPO)4种防御酶的酶活性变化。结果表明:L1-9菌株发酵液浸泡黄瓜种子,可促进黄瓜须根的增加和根伸长,对黄瓜枯萎病具有明显的防治效果;浸种处理后黄瓜幼苗根部PAL、POD、PPO、SOD 4种酶活性明显高于对照,4种酶活性高峰时期不同,表明L1-9菌株发酵液浸泡种子能够明显诱导黄瓜对枯萎病的抗性。

灭活枯草芽孢杆菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1表达的影响

以体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞(ovine rumen epithelial cells,ORECs)为试验模型,旨在探究灭活枯草芽孢杆菌对ORECs绵羊β-防御素-1(sheepβ-defesin-1,SBD-1)表达的影响。首先用不同浓度的灭活枯草芽孢杆菌(10^(7)、10^(8)、10^(9)、10^(10)、10^(11)CFU/mL)诱导ORECs 8 h,通过荧光定量PCR(qPCR)和ELISA的方法检测ORECs SBD-1表达量在mRNA水平和蛋白水平的变化,确定灭活枯草芽孢杆菌诱导ORECs SBD-1表达最高的菌液浓度为最佳刺激浓度。以该浓度的灭活枯草芽孢杆菌诱导ORECS不同时间(2 h、4 h、8 h、12 h),通过qPCR和ELISA的方法检测ORECs SBD-1表达量在mRNA水平和蛋白水平的变化,从而筛选出诱导SBD-1表达的最佳时间。结果表明,10^(8)~10^(11)CFU/mL的灭活枯草芽孢杆菌可以显著的促进ORECs SBD-1的表达,其中灭活枯草芽孢杆菌的浓度为10^(10)CFU/mL时诱导ORECs 8h时SBD-1 mRNA表达量最高,与对照组相比差异极显著(P<0.01);SBD-1蛋白表达量以10^(10)CFU/mL灭活枯草芽孢杆菌诱导ORECs 12 h时达到最大,与对照组相比差异极显著(P<0.01)。结果证明了热灭活后的枯草芽孢杆菌仍可以诱导SBD-1表达,其诱导SBD-1表达的有效成分并未被热灭活,为后续确定枯草芽孢杆菌诱导SBD-1表达的有效成分的研究提供了理论基础。

枯草芽孢杆菌细胞壁对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1表达的影响

为探究枯草芽孢杆菌细胞壁能否对绵羊瘤胃上皮细胞(ovine ruminal epithelial cells, ORECs)中绵羊β-防御素-1(sheepβ-defesin-1,SBD-1)的表达产生影响,先利用反复冻融和超声波破碎相结合的方法破碎枯草芽孢杆菌并成功收集其细胞壁,将不同浓度(0、25、50、100、200、400μg·mL^(-1))的枯草芽孢杆菌细胞壁与ORECs共培养8 h后,采用荧光定量PCR和酶联免疫吸附测定(ELISA)方法筛选出枯草芽孢杆菌细胞壁诱导SBD-1表达的最佳刺激浓度,最后用该浓度条件下的枯草芽孢杆菌细胞壁对瘤胃上皮细胞进行不同时间(2、4、8、12、24 h)的刺激,采用荧光定量PCR和ELISA方法筛选出枯草芽孢杆菌细胞壁诱导SBD-1表达的最佳刺激时间。结果显示:枯草芽孢杆菌细胞壁成功制备,不同浓度(0、25、50、100、200、400μg·mL^(-1))的枯草芽孢杆菌细胞壁对ORECs均无毒性作用,并能极显著促进ORECs中SBD-1 mRNA和蛋白的表达(P<0.01),以浓度为50μg·mL^(-1)的枯草芽孢杆菌细胞壁刺激ORECs 12 h时SBD-1 mRNA和蛋白的表达量达到最大且与对照组呈极显著差异(P<0.001)。研究表明,枯草芽孢杆菌细胞壁刺激ORECs诱导SBD-1表达的最佳刺激浓度为50μg·mL^(-1),最佳刺激时间为12 h。本研究为枯草芽孢杆菌细胞壁诱导调节SBD-1机制的研究提供理论依据。

重组胰高血糖素样肽-1载体的构建及其在枯草芽孢杆菌中的表达

目的:构建及鉴定携带His标签的重组胰高血糖素样肽-1(modified glucagon-like peptide-1,mGLP-1)表达载体,实现其在枯草芽孢杆菌WB800N中的分泌表达。方法:经化学合成得到含有His标签及BamHⅠ/XbaⅠ酶切位点的mGLP-1基因片段,将其酶切后插入含信号肽amy Q序列的大肠埃希菌-枯草芽孢杆菌双穿梭载体pHT43中,得到重组载体pHT43-mGLP-1;通过电转化方法将质粒pHT43-mGLP-1转化到枯草芽孢杆菌WB800N中,构建含有目的基因的重组菌株WB800N/pHT43-mGLP-1,利用聚合酶链式反应(PCR)、碱基测序、甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)及蛋白质印迹法鉴定重组的枯草芽孢杆菌。结果:菌落PCR和测序结果表明,阳性克隆质粒pHT43-mGLP-1成功转化进枯草芽孢杆菌WB800N;Tricine-SDS-PAGE和蛋白质印迹法检测表明,重组菌株WB800N/mGLP-1培养上清液中有mGLP-1蛋白表达,且1 mmol/L IPTG诱导下蛋白表达量明显增加。结论:成功构建了携带mGLP-1基因的表达载体并实现了其蛋白在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,为后续动物实验和制备微生态活菌制剂奠定了基础。

重组枯草芽孢杆菌的构建及对甾体的C_(1，2)位脱氢

本文将简单节杆茵3-甾酮-1-脱氢酶基因克隆到分泌表达载体pWB980上,并转入枯草芽孢杆菌WB600中,得到重组芽孢杆菌菌株。重组芽孢杆菌表达出的目的蛋白的分子量为55KDa,分光光度法检测到胞内和胞外可溶性部分的酶活分别为110±0．5mU和15±0．6mU每毫克蛋白,对甾体底物4-AD的转化率为45．3%,比出发茵简单节杆菌提高了将近10倍。

响应面法优化Bacillus subtilis XH-13_UV3-8产葡萄糖-1-磷酸的发酵条件

应用响应面法对Bacillus subtilis XH-13_UV3-8生产葡萄糖-1-磷酸的发酵条件进行了优化。首先采用Plackett-Burman设计法对12个相关影响因素的效应进行评价,筛选出了有显著正效应的酵母浸粉浓度和K2HPO4·3H2O浓度和有显著负效应的pH等3个因素;接着用最陡爬坡路径逼近最大响应区域;最后通过Box-Behnken设计法,利用Design-Expert软件进行二次回归分析,得到主要因素的最佳条件为:酵母浸粉0.8%、K2HPO4·3H2O0.7%和pH6.6,在此优化培养条件下,发酵液中葡萄糖-1-磷酸浓度从6.85mg/mL提高到8.56mg/mL。

基于HS-SPME-GC-MS的Bacillus subtilis Czk1挥发性物质的萃取条件优化

旨在建立一种快速测定枯草芽孢杆菌Czk1挥发性物质的方法。以总峰个数和总峰面积为指标,采用顶空固相微萃取气相色谱质谱联用技术鉴定枯草芽孢杆菌Czk1的挥发性物质,采用单因素和正交试验确定最佳萃取条件,并在此条件下对Czk1的挥发性物质组分进行分析。最佳组合为50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头、萃取温度40℃,萃取时间40 min,解吸时间7 min,升温程序4。在此优化条件下,共获得33种挥发性物质,其主要组分含有酮类(28.65%)、酚类(13.51%)、酯类(9.17%)、醛类(15.60%)、醇类(12.08%)、碳氢化合物(4.49%)、其他类物质(10.58%)。该萃取方法的建立可为枯草芽孢杆菌Czk1挥发性物质的分析提供参考。

紫外线对枯草芽孢杆菌生产菌株的诱变与筛选

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种革兰氏阳性菌,具有种类多、分泌蛋白能力强、安全性好等优点,是一种重要工业酶和工业制剂的菌种,被广泛应用于医药、食品、农业、饲料、造纸和纺织等多种领域。为了进一步提高枯草芽孢杆菌的发酵能力,采用紫外线照射的方法诱导筛选高产菌株。对通过紫外线诱导提高枯草芽孢杆菌产淀粉酶、蛋白酶、α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactate decarboxylase,简称α-ALDC)、3-羟基丁酮(Acetoin)和葡萄糖-1-磷酸(Glucose-1-phosphate,简称G-1-P)能力的条件进行了比较。