枯草芽孢杆菌XF-1中脱乙酰几丁质酶在大肠杆菌中的表达及其抑菌活性

根据脱乙酰几丁质酶同源基因序列设计引物,扩增、克隆和测序了枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis菌株XF-1的脱乙酰几丁质酶基因(csn)。该基因编码区为834bp,编码由277个氨基酸组成的约30kD的蛋白质,其基因序列与枯草芽孢杆菌菌株B168的脱乙酰几丁质酶基因的相似性达到99%,氨基酸序列相似性为98%,在第19、47、60、256和257位的氨基酸发生了变化,分别由异亮氨酸代替了菌株B168脱乙酰几丁质酶中的甲硫氨酸、缬氨酸代替了谷氨酸、苏氨酸代替了异亮氨酸、天冬氨酸代替了谷氨酸、赖氨酸代替了天冬酰胺。菌株XF-1对稻瘟病菌Magnaporthe oryzae和芸薹根肿菌Plasmodiophora brassicae有抑制作用,而菌株B168没有。菌株XF-1和B168的csn基因在大肠杆菌Escherichia coli中的表达产物均具有脱乙酰几丁质酶活性,但前者的表达产物对稻瘟病菌及芸薹根肿菌具有抑制作用,而后者没有。表明脱乙酰几丁质酶是XF-1抑制根肿病作用机制之一,且上述5个氨基酸替代可能与抑菌机制有关。

枯草芽孢杆菌XF-1提取物对11种植物病原菌的抑制作用

采用盐酸和甲醇抽提法,提取了枯草芽孢杆菌XF-1(Bacillus subtilis XF-1)的抑菌物质。以该提取物处理根肿菌孢子2 d,有50%孢子活性被抑制;处理9 d后,孢子萌发相对抑制率始终保持在90%以上。提取物对三七根腐病菌、水稻纹枯病菌、禾谷镰刀菌、魔芋基腐菌、烟草赤星菌生长抑制率分别为71.97%、62.23%、60.96%、60.70%和57.92%。

枯草芽孢杆菌XF-1膏状悬浮剂增稠剂的筛选

生物相容性、贮存稳定性和析水性研究表明,先糊化6%可溶性淀粉成初级增稠剂,再在100 mL初级增稠剂中加入1 g枯草芽孢杆菌XF-1原粉和35 g可溶性淀粉所组成的初级悬浮剂,具有很好的热稳定性和耐冷性,XF-1菌体数达9.30×1010 CFU/g。

枯草芽孢杆菌XF-1的碳水化合物活性酶类(CAZymes)蛋白预测与遗传关系分析

枯草芽孢杆菌XF-1对多种植物病原菌具有较好的抑制作用,是农业生产上非常重要的生防菌之一.碳水化合物活性酶类蛋白(CAZymes)作为植物病原真菌、细菌中重要的蛋白,在其生长和发育过程中发挥着重要作用.基于前期获得的枯草芽孢杆菌XF-1中104个分泌蛋白基本序列信息,利用CAT预测程序对该菌中的CAZymes蛋白进行预测分析,明确其含有CAZymes蛋白的数量是58个,上述蛋白可以分为主要类别和复合类别两大类,前者包括26个GHs、21个CBMs以及2个CEs、3个PLs、2个GTs;后者则包括4个复合蛋白类型GH/CBM.该研究有效地实现了枯草芽孢杆菌XF-1中CAZymes的预测,为进一步开展其功能研究打下坚实的理论基础.

枯草芽孢杆菌CH-1降解羽毛产物对Cr(Ⅵ)的还原作用

本研究旨在探索一种对环境友好的方法以减少重金属六价铬Cr(Ⅵ)的毒性。采用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CH-1发酵羽毛,制备出富含半胱氨酸的羽毛发酵液(Feather Fermentation Broth,FFB)。实验结果显示FFB能够有效地将有毒的六价铬还原为相对无害的三价铬。通过对FFB的β-角蛋白酶酶活性、半胱氨酸浓度以及对六价铬Cr(Ⅵ)的还原率的测定。我们发现FFB中β-角蛋白酶酶活性在21 h左右达到最大值,而半胱氨酸含量在36 h达到最高值,Cr(Ⅵ)的还原效果最佳时间也是36 h。值得注意的是,即使经过高压高温处理,FFB对Cr(Ⅵ)的还原力并未受到影响,表明还原过程不依赖于生物酶的作用。进一步实验,将FFB上清原液浓缩5倍后处理重铬酸钾溶液,发现浓缩液的还原效果是原始上清液效果的1.5倍。研究表明枯草芽孢杆菌CH-1能较好地降解羽毛废弃物,水解产物中含大量半胱氨酸,对Cr(Ⅵ)具有显著的还原能力。综上所述,本研究提供了一种使用枯草芽孢杆菌CH-1无公害处理羽毛废弃物的新策略,并为其在循环农业生态系统中的应用提供了理论依据和精确计算方法。这一发现对于实现农业废弃物资源化利用,以及环境中有毒六价铬的安全处理具有重要意义。

枯草芽孢杆菌Czk1与化学杀菌剂复配对橡胶树炭疽病和白粉病的防效测定

为使生防菌部分甚至完全替代化学药剂来防治植物病害,降低化学药剂使用量,削弱化学药剂对生态环境造成的破坏,本研究根据橡胶树炭疽病和白粉病分级标准,对田间施药前后橡胶树叶片进行取样调查。结果表明,对橡胶树炭疽病防效最好的复配剂是Czk1+25%咪鲜胺复配剂中浓度,防效为75.18%。Czk1+25%丙环唑戊唑醇复配剂高浓度的防效为58.24%,低于Czk1+25%咪鲜胺复配剂中浓度,但两者之间的差异不显著。Czk1+25%丙环唑戊唑醇复配剂中浓度、Czk1+25%咪鲜胺复配剂低浓度的防效与对照药剂16%百菌清咪鲜胺三唑酮的防效未有显著差异,分别为39.02%、35.99%和25.57%,但均显著低于Czk1+25%咪鲜胺复配剂中浓度;防治橡胶树白粉病效果较好的复配剂是Czk1+25%丙环唑戊唑醇复配剂中浓度,防效为71.34%。Czk1+25%丙环唑戊唑醇复配剂高浓度、Czk1+25%咪鲜胺复配剂中和低浓度,防效分别为59.54%、64.27%和59.51%,显著低于Czk1+25%丙环唑戊唑醇复配剂中浓度,4个参试浓度复配剂的防效均显著优于对照药剂16%百菌清咪鲜胺三唑酮;增效作用研究结果表明,对防治橡胶树炭疽病和白粉病增效作用最强的复配剂均为Czk1+25%咪鲜胺复配剂中浓度,Czk1+25%丙环唑戊唑醇复配剂只对防治白粉病表现出较好的增效作用,对防治炭疽病的增效作用不明显。Czk1+25%咪鲜胺复配剂中浓度和Czk1+25%丙环唑戊唑醇复配剂中浓度分别对橡胶树炭疽病和白粉病表现出了较好的防效,同时实现了化学农药的减量和增效作用,为开发绿色、高效、可持续的新型橡胶树两种病害防治手段提供了理论支持和实践经验。

枯草芽孢杆菌肽聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(SBD-1)表达的影响

为了探究来源于枯草芽孢杆菌细胞壁的肽聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞(ORECs)中β-防御素-1(SBD-1)表达的影响,本试验使用30μg/mL肽聚糖刺激ORECs不同时间(2、4、6、8、10和12 h),采用荧光定量PCR(qPCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)方法分别检测SBD-1的mRNA和蛋白表达量,确定最佳刺激时间;再使用不同浓度的肽聚糖(0、10、20、30、40和50μg/mL)刺激ORECs 2 h,采用qPCR和ELISA方法检测SBD-1的mRNA和蛋白表达量,确定最佳刺激浓度。结果显示:(1)使用30μg/mL肽聚糖刺激ORECs不同时间时,SBD-1的mRNA和蛋白表达量随着时间的增加呈先下降后升高的趋势,2 h时表达量最多并极显著高于对照组(P<0.001)。(2)使用不同浓度肽聚糖刺激ORECs 2 h时,SBD-1的mRNA和蛋白表达量随着肽聚糖浓度的升高呈现先升高后降低的趋势,在20μg/mL时表达量最多并极显著高于对照组(P<0.001)。(3)不同时间刺激试验和不同浓度刺激试验均不会对ORECs产生细胞毒性作用。结果表明,来源于枯草芽孢杆菌的肽聚糖能够诱导ORECs表达SBD-1,最佳刺激条件为20μg/mL枯草芽孢杆菌肽聚糖刺激ORECs 2 h。

枯草芽孢杆菌WTX1胞外酶降解AFB_(1)酶学特性及降解位点分析

为丰富生物降解黄曲霉毒素B_(1)(AFB_(1))资源,研究已筛选到的枯草芽孢杆菌WTX1降解AFB_(1)的胞外酶特性及其降解位点。通过降解与AFB_(1)毒性位点结构相似的3种化合物,采用液相色谱串联三重四级杆质谱(UPLC-MS/MS)检测降解液。经层析分离,降解AFB_(1)胞外酶主要有Ea、Eb两种。最适降解条件:降解酶Ea降解温度为50℃,pH 5,降解率高达88.4%;降解酶Eb降解温度为37℃,pH 5,降解率为73.4%;Ea酶的作用位点为AFB_(1)的呋喃环双键、香兰素内脂环、戊烯酮环结构,Eb酶的作用位点为AFB_(1)的香兰素内脂环、戊烯酮环结构。酶组降解途径为通过水解作用,加氢及连续脱去-CO基团。菌株WTX1胞外酶通过水解作用破坏AFB_(1)毒性位点,起到降解作用,该酶具有很好的抗逆性,温度和pH适应性适合工业化加工的苛刻条件。

枯草芽孢杆菌细胞壁通过TLR-2-MyD88-NF-κB/MAPK信号通路调控绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1的表达

为了探索枯草芽孢杆菌细胞壁诱导绵羊β-防御素-1(SBD-1)表达的主要信号转导途径,本试验首先使用反复冻融法与超声波破碎法相结合的方法破碎枯草芽孢杆菌并收集其细胞壁,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测方法分析细胞壁成分及其含量,然后利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)方法检测枯草芽孢杆菌细胞壁刺激绵羊瘤胃上皮细胞(ORECs)后通路因子(TLR-2、MyD88、NF-κB、p38、JNK和ERK1/2)mRNA和蛋白的表达变化,最后使用通路抑制剂分别阻断NF-κB、p38、JNK和ERK1/2信号通路,用枯草芽孢杆菌细胞壁刺激ORECs并检测刺激后SBD-1 mRNA表达变化,从而确定诱导SBD-1表达的主要信号通路。结果显示,枯草芽孢杆菌细胞壁制备成功,细胞壁主要成分为肽聚糖和磷壁酸,含量分别为(90.85±0.91)%和(8.85±0.11)%。与对照组相比,枯草芽孢杆菌细胞壁刺激ORECs后信号通路因子(TLR-2、MyD88、NF-κB、p38、JNK和ERK1/2)的mRNA和蛋白的表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01),使用通路抑制剂阻断各个信号通路后再刺激ORECs,SBD-1 mRNA表达水平均极显著下降(P<0.01),且添加NF-κB和JNK抑制剂组下降幅度最大。结果表明,枯草芽孢杆菌细胞壁可能通过TLR-2-MyD88-NF-κB/MAPK信号通路调控ORECs SBD-1的表达。

枯草芽孢杆菌培养上清液对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1表达的影响

[目的]探究枯草芽孢杆菌培养上清液对绵羊瘤胃上皮细胞(ovine ruminal epithelial cells,ORECs)中绵羊β-防御素-1(sheepβ-defesin-1,SBD-1)表达的影响。[方法]采用Cell Counting kit-8(CCK-8)方法筛选对ORECs无明显毒性作用的枯草芽孢杆菌培养上清液刺激浓度范围与刺激时间范围。用筛选出的无明显毒性作用的不同浓度枯草芽孢杆菌对应的培养上清液刺激ORECs 8 h后,采用荧光定量PCR(qPCR)技术和酶联免疫吸附(ELISA)检测方法筛选枯草芽孢杆菌培养上清液诱导SBD-1表达的最佳刺激浓度,以该浓度枯草芽孢杆菌对应的培养上清液刺激ORECs不同时间,采用qPCR技术和ELISA检测方法确定枯草芽孢杆菌培养上清液诱导SBD-1表达的最佳刺激时间。[结果]①对ORECs无明显毒性作用的枯草芽孢杆菌对应的培养上清液浓度范围为10^(7)~10^(11) CFU/mL,刺激时间范围为2~24 h。②利用qPCR技术和ELISA检测方法筛选出最佳刺激浓度为10^(11) CFU/mL枯草芽孢杆菌对应的培养上清液。③以该浓度枯草芽孢杆菌对应的培养上清液刺激ORECs不同时间,采用qPCR技术和ELISA检测方法确定枯草芽孢杆菌培养上清液诱导SBD-1表达的最佳刺激时间为24 h。[结论]枯草芽孢杆菌培养上清液可以诱导ORECs SBD-1的表达。

多粘类芽孢杆菌BRF-1和枯草芽孢杆菌BRF-2对黄瓜和番茄枯萎病的防治效果

采用室内培养方法，对生防细菌多粘类芽孢杆菌BRF-1和枯草芽孢杆菌BRF-2不同稀释倍数的代谢产物抑制黄瓜尖孢镰刀菌、番茄枯萎病菌分生孢子萌发和菌丝生长的试验结果表明，当两菌株代谢产物稀释5倍时，对分生孢子萌发的抑制率达到80％以上；两菌株代谢产物在稀释2倍和5倍时，对2种病原真菌菌丝生长的抑制率在40％-80％之间，与对照差异极显著（P〈0．01）。盆栽试验表明，BRF-1和BRF-2生防细菌菌悬液及其无菌代谢物对黄瓜和番茄枯萎病不仅具有较好的防治效果，而且具有明显的促进生长作用。

枯草芽孢杆菌BS菌株和哈茨木霉TH-1菌株对棉花枯黄萎病菌的拮抗作用

棉花枯萎病和黄萎病(简称枯、黄萎病)均是棉花主要病害,且均属土壤传播的维管束病害,防治上有很大难度,目前主要采取选育选用抗病品种为主的综合治理措施。然而由于迄今尚缺乏理想的高抗丰产品种和有效药剂,且化学药剂对环境污染问题日益突出,生物防治日益受到重视。关于拮抗菌对棉花枯、黄萎病菌的生防作用已有一些研究,但同时针对棉花枯、黄萎病开展的研究则鲜有报道。鉴于安徽棉区两病混发,且以枯萎病为主,作者就枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS菌株和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)TH-1菌株对棉花枯萎病菌和黄萎病菌的拮抗作用及其机制进行了研究,以期为开发兼治两病的生防制剂提供必要的试验依据。

利用转座子TnYLB-1构建枯草芽孢杆菌的突变体文库

为了鉴定枯草芽孢杆菌定殖和促进植物生长相关基因,用携带转座子TnYLB-1的穿梭载体pMarA转化枯草芽孢杆菌OKB105菌株。高温诱变条件下,筛选了2 000个转座子插入突变的单克隆,构建了OKB105菌株的突变体文库。对随机挑选的15个突变体采用PCR及Southern杂交验证,结果表明:转座子TnYLB-1以单拷贝、随机方式插入到OKB105菌株的染色体上。

枯草芽孢杆菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1表达的影响

选用益生枯草芽孢杆菌研究其对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素表达的调节作用。首先,在体外成功培养绵羊瘤胃上皮细胞,然后用枯草芽孢杆菌对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞进行不同浓度、不同时间的刺激,利用荧光定量PCR技术(Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-PCR)从mRNA水平检测刺激后上皮细胞中绵羊β-防御素-1(Sheep beta-defensin-1,SBD-1)基因表达水平的差异。结果表明:当菌液浓度为1010 cfu·mL-1刺激上皮细胞8h后,SBD-1的表达量达到最高;不同的菌液浓度诱导下SBD-1的表达量均有显著增加,109、1010、1011 cfu·mL-1菌液浓度刺激下,SBD-1的表达量与空白相比差异极显著(P<0.01)。结果表明,枯草芽孢杆菌能够诱导绵羊瘤胃上皮细胞内SBD-1基因的表达。

枯草芽孢杆菌Natto3的筛选及其降解黄曲霉毒素B_1的初步研究

从可食用的纳豆中筛选出一株能够高效降解黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,简称AFB1)的细菌,该细菌的发酵上清液经浓缩后制成的粗酶液对AFB1降解率达到91.4%。对该菌进行了分类地位鉴定并初步研究了粗酶液的酶学性质。结果表明,该菌经生理生化和16S r DNA序列比对鉴定为枯草芽孢杆菌,并命名为Natto3。Natto3的粗酶液降解AFB1的最适培养时间为72h,最适反应温度为37℃,最适p H值是8.5,Zn2+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、Li+五种金属离子均会不同程度地抑制降解活性。此外,将该粗酶液添加在被黄曲霉毒素高度污染的花生样品中进行脱毒实验,可使花生中AFB1的浓度从192μg/kg降至43μg/kg。

枯草芽孢杆菌R31和TR21菌株防治香蕉枯萎病田间药效试验

研究了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)R31菌株和TR21菌株单独及混合使用防治农科1号香蕉(Musa AAA Cavendishsubgroup cv.Nongke No.1)枯萎病的田间效果。收获期结束后统计的结果表明,R31处理区香蕉枯萎病发病率为4.05%,TR21处理区发病率为8.70%,TR21+R31(V:V=1:1)处理区发病率4.59%,对照区发病率21.88%,防效分别为81.86%、61.09%和79.45%;折算每667m2经济损失率比对照分别减少34.46%、25.90%、32.50%。研究结果表明两株枯草芽胞杆菌具有较好的应用前景。

泰山枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其对黄曲霉毒素B_1的降解研究

本试验旨在从泰山土壤中筛选出具有降解黄曲霉毒素B1(AFB1)作用的枯草芽孢杆菌,经16SrRNA基因测序鉴定为枯草芽孢杆菌,最终确定1株具有较高降解作用的枯草芽孢杆菌,命名为泰山枯草芽孢杆菌,并利用该菌株对AFB1进行了降解率、活性组分、性质的确定及降解饲料中AFB1效果的研究。结果表明,泰山枯草芽孢杆菌对AFB1的降解率达90.28%,其中,泰山枯草芽孢杆菌发酵后的上清液对AFB1的降解活性最高,确定发酵后的上清液中存在解毒活性组分;对解毒活性物质进行加热和蛋白酶K变性处理后,解毒活性显著降低,表明起解毒作用的活性物质是其分泌的一种胞外酶;应用性试验进一步证明泰山枯草芽孢杆菌能降解霉变饲料中的AFB1,可在饲料或食品行业应用。

枯草芽孢杆菌对饲喂含黄曲霉毒素B1日粮蛋鸡产蛋性能和蛋品质及血清生化指标的影响

试验旨在探讨枯草芽孢杆菌对饲喂含黄曲霉毒素B1(AFB1)霉变花生粕饲粮蛋鸡的产蛋性能、蛋品质和血清生化指标的影响。选用52周龄健康海兰褐蛋鸡240只,随机分为5个组,每组4个重复,每个重复12只鸡,分别为基础日粮A组和添加9%和18%的发霉花生粕(AFB1含量为330.2μg/kg)B、C组,在B、C日粮基础上添加0.5%枯草芽孢杆菌粉的D、E组。结果表明:与仅添加霉变花生粕组相比,添加枯草芽孢杆菌可显著提高蛋鸡的产蛋率和蛋壳强度、降低料蛋比(P<0.05),显著降低蛋鸡血清中碱性磷酸酶和谷丙转氨酶(P<0.05),升高白蛋白(P<0.05),可不同程度地改善蛋黄色泽及提高血清中雌激素、T3和T4含量。由此可见,枯草芽孢杆菌在一定程度上缓解了AFB1对机体的危害。

生防内生枯草芽孢杆菌Jaas ed1在西瓜植株内的定殖能力检测

分别对枯草芽孢杆菌Jaas ed1进行利福平(Rif)抗性标记和绿色荧光蛋白(GFP)标记,获得Rif抗性标记的菌株Jaas ed1R及GFP标记的菌株Jaas ed1-GFP,并初步研究Jaas ed1在西瓜植株中的定殖能力。定殖结果表明,在灌根接种Jaas ed1R后的35 d内能在西瓜苗根部检测到Jaas ed1R,20 d内能在茎部检测到Jaas ed1R;并且在根部定殖的数量显著大于茎部,接种后3 d根部Jaas ed1R的数量为1.62×104cfu·g-1鲜重,茎部为2.95×102cfu·g-1鲜重。灌根接种Jaas ed1-GFP后的第3天,在荧光显微镜下观察到西瓜苗根部存在大量的Jaas ed1-GFP,在激光共聚焦显微镜观察到西瓜苗茎内的Jaas ed1-GFP分布集中在维管束中。说明内生枯草芽孢杆菌Jaas ed1能够在西瓜植株体内定殖,能够从土壤中进入西瓜根部组织,并且能够侵入到茎部微管束组织中,从而在整个植株体内转移。

枯草芽孢杆菌发酵制剂对饲喂含AFB1饲料肉鸡血清生化指标和肝功能的影响

本试验旨在探讨枯草芽孢杆菌发酵制剂对饲喂含AFB1饲料肉鸡血清生化指标和肝功能的影响。选择1日龄健康AA+肉仔鸡180只,随机分为3组,每组5个重复,每个重复12只鸡。Ⅰ组饲喂基础日粮,Ⅱ组在基础日粮中添加100μg/kg AFB1,Ⅲ组在Ⅱ组基础上添加0.1%枯草芽孢杆菌发酵制剂。结果表明:Ⅱ组出栏体重、采食量显著下降、料重比显著升高,Ⅲ组与Ⅰ组无显著差异(P>0.05);Ⅱ组肝脏的相对质量最高、Ⅰ组最低,Ⅲ组显著低于Ⅱ组(P<0.05);肝脏和粪便中AFB1残留量Ⅱ组最高、Ⅰ组最低,Ⅲ组显著低于Ⅱ组(P<0.05);血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶和碱性磷酸酶的活性Ⅱ组最高、Ⅰ组最低,Ⅲ组显著低于Ⅱ组(P<0.05);血清总蛋白、白蛋白和球蛋白含量Ⅱ组显著低于Ⅰ组和Ⅲ组(P<0.05),Ⅰ组和Ⅲ组无显著差异(P>0.05)。结果表明AFB1可引起肉鸡出栏体重降低、采食量降低、料重比增加;增加肝脏的相对质量及肝脏和粪便中AFB1残留量,升高血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶和碱性磷酸酶的活性,降低血清总蛋白、白蛋白和球蛋白含量;枯草芽孢杆菌发酵制剂能够在一定程度上改善AFB1对机体的损害和减少其在肝脏中残留。