枯草芽孢杆菌YT168-6产抗菌肽sublancin的发酵工艺优化及培养基筛选的研究

研究旨在探索枯草芽孢杆菌YT168-6产抗菌肽sublancin的最适发酵条件和最适培养基组成,以期提高发酵液中sublancin含量。试验先通过单因素试验筛选出最适发酵条件,确定发酵培养基需要的无机盐、碳源、氮源,再通过正交试验、最陡爬坡试验、Box-Behnken设计的响应面分析方法确定最适发酵培养基组成。结果表明:枯草芽孢杆菌YT168-6产抗菌肽sublancin的最适发酵条件为菌种接种量1.0%、发酵温度37℃、发酵液初始pH 7.0;最适发酵培养基为K_(2)HPO_(4)5 g/L、KH_(2)PO_(4)5 g/L、MgSO_(4)10 g/L、可溶性淀粉30.2 g/L、蛋白胨23.6 g/L、玉米浆18.2 g/L;优化后sublancin产量由756μg/mL提到1581μg/mL,是优化前的2.09倍。综上所述,本研究所筛选的最适发酵条件和最适培养基可为枯草芽孢杆菌YT168-6菌株工业化生产sublancin提供技术参考。

Bacillus globisporus N75 6-α-葡萄糖基转移酶在枯草芽孢杆菌中的重组表达

6-α-葡萄糖基转移酶具有催化α-1,4-葡聚糖的外切水解和转糖基化功能,可通过转糖基活性产生非还原端连有α-1,6键的α-葡聚糖,可用于生产环交替糖及其分支衍生物和环异麦芽寡糖等新型功能糖。为了更好地将6-α-葡萄糖基转移酶应用于食品领域,该研究对来源于Bacillus globisporus N75的6-α-葡萄糖基转移酶在食品安全级菌株枯草芽孢杆菌中进行重组表达,并通过表达宿主的选择及优化发酵条件进一步提高重组蛋白产量。结果表明,宿主WHS9更有利于6-α-葡萄糖基转移酶的重组表达,在20℃的发酵条件下,胞内外可溶性总酶活力可达2.11 U/mL;在25℃添加20 mmol/L海藻糖发酵48 h后,总酶活力可达到2.21 U/mL;优化发酵时间后,发酵36 h总酶活力可达3.14 U/mL,是优化前WHS9表达酶活力的196倍。该研究首次实现了6-α-葡萄糖基转移酶在枯草芽孢杆菌中的重组表达。

枯草芽孢杆菌6-磷酸葡萄糖脱氢酶的纯化及性质

枯草芽孢杆菌通过超声破壁,(NH4)2SO4分段盐析,DEAE SepharoseFF离子交换层析,Blue SepharoseCL 6B亲和层析,SephadexG 200凝胶过滤等纯化步骤,分离出6 磷酸葡萄糖脱氢酶。经PAGE和SDS PAGE检测为单一蛋白区带,比活1 7375IU/mg,纯化倍数72 7,收率13 6%。凝胶过滤法测定表观分子量220KD,SDS PAGE测定亚基分子量50 5KD,可见该酶是由四个相同亚基构成的四聚体。测定最适pH、温度分别为8 5,37℃,底物G6P的Km值0 177mmol·L-1。考察了部分金属离子及EDPA对该酶活性、紫外、荧光光谱的影响。

枯草芽孢杆菌结合3506-2基质使用防治甘蓝根肿病药效试验初报

本研究比较了5种不同措施防治甘蓝根肿痛的效果,结果表明:采用枯草芽孢杆菌粉剂(2.0×10~6cfu/g)400倍液结合3506—2基质处理防治根肿病平均发病率最低(13.70%)、病情指数最低(5.23)、防治效果最好(79.12%)、产量最高(8 094.05kg/667m^2),而且无农药残留,成本约180元/667m^2,符合生产绿色甘蓝食品发展方向,建议在大田防治甘蓝根肿痛中推广应用。

一种源于枯草芽孢杆菌的新型甘露糖-6-磷酸异构酶的基因克隆与表达

通过PCR克隆了一种来自枯草芽孢杆菌str. 168菌株的甘露糖-6-磷酸异构酶编码基因(BSMPI-2),利用p ET-28a载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株。经IPTG诱导实现了BSMPI-2蛋白的表达,经过亲和层析纯化和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证,证实目的蛋白分子量约3. 54×10~4,BSMPI-2以L-核糖为底物时的最适反应条件为pH 8. 0、60℃、外源添加0. 5 mmol/L Co^(2+),该酶催化2 h可将29%的L-核糖异构为L-核酮糖。

枯草杆菌6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的分离纯化及部分性质研究

采用DEAE Sepharose离子交换层析,Blue SepharoseCL 6B特异结合层析和SephadexG 200凝胶过滤技术,对枯草芽孢杆菌中的6 磷酸葡萄糖酸脱氢酶进行了分离纯化.纯化倍数为112.3倍,比活为1.46U/mg,回收率为8.2%.纯化酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳检验为单一带.测得全酶相对分子质量为107kD,具有两个分子量相同的亚基,亚基相对分子质量为51kD.最适pH值为8.0,最适温度为30℃,对热不稳定.以6 磷酸葡萄糖酸和NADP+为底物,其Km值分别为Km1(NADP+)=19.8μmol/L和Km2(6 GPA)=22.6μmol/L.在5mmol/L～50mmol/L浓度范围内,Mg2+,Ca2+和Mn2+对酶有激活作用,Fe3+和Cu2+对酶有抑制作用,K+,Na+,Cl-,NO-3,SO-4对酶几乎没有影响.用PMSF,TNBS,NBS,DTT和BrAc对酶进行修饰,实验结果表明,丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸和组氨酸残基可能是该酶活性中心的功能基团.

杀线虫芽孢杆菌B16和枯草芽孢杆菌168硫酯酶Ynep差异分析

【背景】线虫生防菌杀线虫芽孢杆菌B16和可作为线虫食物的枯草芽孢杆菌168对线虫存在差异感知,线虫引诱剂2-庚酮的表达量也存在显著差异。【目的】研究线虫生防菌芽孢杆菌B16和可作为线虫食物的枯草芽孢杆菌168中合成甲基酮的关键因子硫酯酶Ynep,并分析它们的异源表达、结构及酶活性质上的差异。【方法】使用定量聚合酶链式反应(quantitativePCR,qPCR)验证两种芽孢杆菌中硫酯酶在转录水平的差异,通过生物信息学分析两种酶结构的差异,并通过蛋白异源表达和活性测试验证其蛋白表达水平及特性的差异。【结果】qPCR显示,在培养12 h和72 h后,菌株B16ynep基因表达分别为菌株168的1.428和0.991倍。生物信息学分析表明两者氨基酸序列一致性为97.12%,酶分子量分别为15993.35 Da和16007.42 Da,等电点(isoelectric point,pI)分别为7.06和7.82,均具有与转录过程中基因表达调控有关的蛋白质(transcriptional enhancer,TE)结构域,均包含保守的Asp16-His23-Tyr26催化三联体。同源建模显示Ynep均呈典型“hot dog”结构,是TE超家族最常见的结构折叠。两种酶存在4个氨基酸差异,可能影响硫酯酶四聚体形成。菌株B16和168 Ynep与底物β-酮酯酰-CoA分子对接,结合能分别为-5.47 kcal/mol和-6.95 kcal/mol。异源表达纯化的酶活性测试显示:菌株B16和168的酶活分别为1.243 U/mL和1.2339 U/mL,最适反应温度均为30°C,最适pH分别为8.0和9.0。两种酶在10-30°C、pH 7.0-8.0均表现出良好的稳定性,且菌株168中Ynep对温度耐受性更佳。【结论】两种芽孢杆菌中的硫酯酶Ynep在异源表达、结构及酶活性质方面均有差异,导致其合成线虫引诱剂2-庚酮量有所不同。这些研究结果有助于解析不同芽孢杆菌差异感知线虫的分子机理,为进一步开发高效新型线虫生防产品提供新思路。

利用味精废水培养枯草芽孢杆菌产γ-聚谷氨酸及初步表征

味精废水是一种高浓度有机废水,具有酸性强、高COD、高BOD、高硫酸根、高菌体含量和低温等特点,其中含有大量的L-谷氨酸、还原糖与氨氮,如果任其排放不仅浪费了宝贵资源,而且会造成严重的环境污染。实验利用味精废水作为培养基,培养枯草芽孢杆菌168得到产物γ-聚谷氨酸,对于探索味精废水的资源化利用途径和降低微生物法合成γ-聚谷氨酸的生产成本具有积极意义。单因素实验研究了培养条件对枯草芽孢杆菌168生长和γ-聚谷氨酸产量的影响,结果表明,味精废水浓度、初始pH、接种量和培养时间对枯草芽孢杆菌168生长和γ-PGA产量具有重要的影响。通过Box-Behnken响应面法进一步优化了枯草芽孢杆菌168的培养条件,优化后的培养条件为:味精废水稀释倍数3.88,培养初始pH 5.84,50 mL味精废水接种量10.55 mL,在37℃、180 r·min^(-1)条件下培养48 h,γ-聚谷氨酸的产量达到(53.51±0.92) g?L^(-1)。茚三酮比色法确定粗产品中γ-聚谷氨酸含量为78.24%(质量分数)。紫外扫描光谱分析显示检测样品中氨基和羧基的特点符合γ-PGA标准图谱特征,γ-聚谷氨酸的聚合键与蛋白质的肽键结构有明显区别,γ-聚谷氨酸是由γ-酰胺键聚合而成。傅立叶红外光谱和核磁共振分析显示,样品中含有酰胺基、羧基、羰基-CH、-CH_2等基团。对紫外光谱、红外光谱和核磁共振结果进行综合分析,可以初步确定样品中存在酰胺键连接的多聚体结构,即γ-聚谷氨酸的结构。研究结果显示,利用味精废水培养枯草芽孢杆菌168得到产物γ-聚谷氨酸在技术上是可行的,为味精废水资源化利用探索出一条可能的途径,且具有降低微生物法合成γ-聚谷氨酸成本的潜力。

基因工程大肠杆菌合成γ-聚谷氨酸

利用PCR方法,从自身不合成γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的Bacillussubtilis168菌的基因组DNA中扩增出γ-PGA合成基因ywsC,ywtA和ywtB,测序并对该基因编码区进行序列分析,比对结果表明,扩增的ywsC,ywtA和ywtB与文献报道的相似度为100%.将3个基因连接到pTrcHisA载体后转化至E.coliTOP10及E.coliBL21(DE3)宿主菌表达,结果宿主菌细胞均具备了γ-PGA生物合成能力,产量最高达到0.134g/L.

乙酰氨基葡萄糖合成关键酶氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶的筛选及酶学性质分析

N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc)是氨基葡萄糖(Glucosamine,GlcN)的衍生物,在保健食品和医药领域具有广泛应用。氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶(glucosamine-6-phosphate N-acetyltransferase,GNA)是N-乙酰氨基葡萄糖合成途径中的关键酶。本研究在前期构建的产GlcNAc枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtilis,B.subtilis)工程菌的基础上,通过过量表达不同来源的GNA,筛选出来源于秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰基转移酶(Cegna1)最适于加强GlcNAc合成途径。在B.subtilis工程菌中表达Cegna1,摇瓶水平发酵GlcNAc产量达到7.31 g/L,与过量表达来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,S.cerevisiae)的GNA的对照菌株相比,GlcNAc的产量提高了24.51%。在3 L发酵罐中进行分批发酵,GlcNAc产量达到24.23 g/L,相较于对照菌株GlcNAc的产量提高了24.69%。进一步研究发现重组Cegna1对GlcN-6P和乙酰辅酶A(Ac-CoA)有着较高的亲和力和催化效率,最后对重组Cegna1的基本酶学性质进行了考察,发现底物GlcN-6P对重组Cegna1的抑制作用明显,下一步可采用定向进化策略改造Cegna1,解除底物GlcN-6P对重组Cegna1的抑制作用。本研究结果为应用定向进化策略改造GNA的实现提供了理论依据。

枯草芽孢杆菌BS80-6对苹果采后炭疽病的控病效果及作用机制

为提高枯草芽孢杆菌的生防效果,通过离子束诱变筛选出BS80-6菌株。利用生物测定方法研究BS80-6菌株及不同处理方法在不同贮藏温度下对采后苹果炭疽病的控制效果和作用机制。结果表明,BS80-6能显著提高对苹果炭疽菌的抑制作用。枯草芽孢杆菌BS80-6对苹果果实炭疽病的防治效果以活菌液效果最好,菌丝生长抑制率为80.14%,孢子萌发抑制率为98.65%,控病效果为60.34%;灭菌液和过滤液对苹果炭疽菌也有一定的抑制效果。贮藏温度明显影响BS80-6对苹果炭疽病的防治效果;接种方式对控病效果影响显著,先接拮抗菌再接病菌的防效好于先接病菌再接拮抗菌。

加强表达6-磷酸果糖激酶提高Bacillus subtilis乙偶姻合成效率

乙偶姻是枯草芽孢杆菌的主要胞外产物,它是一种广泛使用的食用香精,同时也可作为重要的化学中间体,因此提高枯草芽孢杆菌乙偶姻的产量和生产效率有重要意义。本研究克隆了编码枯草芽孢杆菌6-磷酸果糖激酶(PFKA)和丙酮酸激酶(PK)的编码基因pfk A和py K,并分别将其在高产乙偶姻的枯草芽孢杆菌BM(敲除了2,3-丁二醇脱氢酶的编码基因bdh A)中过量表达。结果表明过量表达PFKA或者PK能有效提高糖酵解速率以及发酵过程的生物量,并且过量表达PFKA与过量表达PK相比更有利于乙偶姻的合成。在5 L发酵罐上对工程菌进行发酵实验发现,经底物流加发酵,乙偶姻产量达到66.8 g/L,生产效率达到0.74 g·(L·h)-1。本研究为利用枯草芽孢杆菌作为细胞工厂生产相关化合物有重要的借鉴意义。

常压室温等离子体和紫外诱变选育腺苷高产菌株

腺苷是一种内源性核苷类物质,在生理生化过程中起着重要的调控作用。使用常压室温等离子体(ARTP)诱变、UV-LiCl诱变和复合诱变,将诱变后的菌株涂布在含最低致死浓度的6-巯基嘌呤(6-MP)抗性平板和不含该抗性的平板上,35℃培养1~2d后对其抗性正突变株进行发酵筛选和传代稳定性考察,获得1株腺苷高产菌株A-Z-L-2,传代6次后其腺苷产量达到20.512g/L,较出发菌株BS-0腺苷产量提高了16.12%,且该菌株具有较好的传代稳定性。

一种新型抗性质粒的构建及其在核黄素生产菌中的运用

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1是课题组前期通过基因工程改造得到的一株核黄素高产菌,为了进一步提高核黄素的产量,需要对该菌株进行进一步的基因工程改造.本研究首先将编码的链丝菌素乙酰基转移酶基因sat克隆到pMA5质粒上,构建具有诺瓦丝菌素Norseothricin(NTC)抗性的重组质粒pMA5-sat,实验证实该重组质粒能够用于B.subtilis RF1的抗性筛选.随后将核黄素合成相关的关键酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶编码基因zwf克隆到重组质粒pMA5-sat上,获得重组质粒pMA5-sat-zwf,并成功构建重组菌B.subtilis RF1/p MA5-sat-zwf.结果显示,重组菌胞内葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力比原始菌提高了近50倍,说明葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在重组菌中成功过量表达;根据发酵特性分析,重组菌B.subtilis RF1/pMA5-sat-zwf最终核黄素产量达到12.01 g/L,比原始菌B.subtilis RF1提高了30.3%.综上,本研究构建的新型抗性质粒能够成功运用于核黄素生产菌枯草芽孢杆菌的基因工程改造.