伊枯草菌素抑菌稳定性及对雪梨采后保鲜的影响

本文旨在研究贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101所产伊枯草菌素的抑菌稳定性及其对采后雪梨的保鲜作用,发掘其潜在应用价值。采用平板对峙法测定了酸碱、温度、反复冻融次数、金属离子、紫外线照射、室温贮藏等条件对伊枯草菌素抑制梨链格孢菌活性的影响,探究了伊枯草菌素对雪梨采后保鲜效果。实验结果表明,伊枯草菌素在p H7~10、温度40℃以下、反复冻融6次、紫外线照射6 h及室温储存等条件下抑菌性能稳定,添加金属离子Na^(+)、Fe^(3+)可使抑菌活性分别提高14.77%和17.93%;伊枯草菌素可以有效控制采后雪梨黑斑病的发生,果实硬度、可滴定酸和还原糖含量较对照组显著提高,具有开发成梨果保鲜剂的潜力。

枯草菌素产生菌芽孢杆菌FB123的发酵条件优化及其16S rRNA序列分析

对芽孢杆菌FB123产枯草菌素发酵条件进行了优化并对菌株进行了16S rRNA分子鉴定。采用不同培养基配方、单因素及正交设计等试验对FB123培养基、发酵条件进行了优化,FB123的枯草菌素产量(透明圈直径:cm)从1.1cm增加到1.67cm;生物量提高了2.5倍。最佳培养基为(%):葡萄糖0.5,蛋白胨1.0,牛肉膏0.5,酵母膏0.1,pH7.5;培养条件:培养温度28℃,培养时间32h。进一步克隆测定了该菌16SrRNA基因序列,系统进化树分析表明该菌与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有最紧密亲缘关系。

甘蔗黑穗病菌拮抗性芽孢杆菌的抗菌作用与伊枯草菌素A的产生有关

选择对甘蔗黑穗病菌有拮抗作用的 5个革兰氏阳性芽孢杆菌拮抗菌株和 3个革兰氏阴性拮抗细菌菌株 ,用 PCR技术 ,扩增抗霉菌枯草杆菌素操纵元中 myc B基因。结果是 ,5个革兰氏阳性芽孢杆菌拮抗菌株均扩增出一条大小为 2 .0 kb左右的特异带 ,革兰氏阳性芽孢杆菌基因组的 PCR产物和伊枯草菌素 A合成酶操纵元中的 Itu B基因的同源性为 97%～ 98% ,说明其抗菌作用机制和 Iturin类群脂肽抗生素的产生有关。 3个革兰氏阴性拮抗细菌中 ,没有扩增到基因 ,其抗菌作用机制有待进一步研究。

大孔吸附树脂分离提取发酵液中伊枯草菌素A的研究

研究了利用大孔吸附树脂从发酵液中提取伊枯草菌素A的工艺条件。对比了不同极性大孔树脂对发酵液中伊枯草菌素A的分离效果,选择DM301型树脂作为吸附剂进行优化试验。结果表明,在25℃时,每升发酵液吸附剂用量为80 g DM301型树脂时,树脂对发酵液中伊枯草菌素A的吸附率可达100%。滤去吸附残液,采用无水乙醇解吸,每克DM301树脂解吸剂用量为10 mL时,静态解吸率达90%以上。动态吸附试验表明,发酵液的最佳上样量为6倍柱床体积,动态解吸流出液活性高度集中。该工艺简单、易操作,适用于工业化生产。

振荡和静态组合式培养改善伊枯草菌素A表达水平

目的以廉价菜粕作为氮源,对其直接生物利用过程中的碳源种类和培养模式进行优化和改进。方法研究液态静置培养模式下细胞生长和伊枯草菌素生产变化特性,在此基础上提出一种两阶段(振荡+静态)组合式培养模式。结果麸皮作为碳源最有利于伊枯草菌素表达,最高浓度是葡萄糖作为碳源时最高产量的1.6倍;液态静置培养基表面能够形成厚而稳定的生物膜,发酵中后期具有比振荡培养更高的伊枯草菌素生产强度;采用液态振荡和静置组合培养方式伊枯草菌素最高浓度可达1.10 g/L,接近完全振荡培养时的最高水平(1.16g/L)。结论相对于传统的全程式振荡培养而言,这种新的组合培养方式不仅有利于伊枯草菌素高产期(发酵中后期)的过程控制,还能降低整个发酵过程的动力成本。

Bacillus velenzensis S3-1基因组中表面活性素、伊枯草菌素和丰原素合成基因簇的定位与分析

通过Gen Bank数据库寻找能产生表面活性素、伊枯草菌素或丰原素并在基因组中其合成基因已得到注释的芽胞杆菌,经过BLAST比对序列初步确定这三类脂肽类抗菌肽的合成基因簇的位置,再运用anti SMASH进行其合成基因簇的最终定位.对表面活性素、伊枯草菌素和丰原素的结构及相关的合成酶结构域进行了预测与分析.

Pythium sp．GY1938菌株类枯草菌素蛋白酶Pr1基因的克隆与序列分析

目的克隆Pythium sp.CY1938菌株类枯草菌素蛋白酶Pr1基因。方法在已经克隆得到的Pythi- um sp.GY1938菌株类枯草菌素蛋白酶cDNA片段的基础上,首先通过PCR扩增得到与其相对应的基因组DNA片段,然后分别通过Mini基因组DNA文库法和Panhandle PCR法扩增其上游和下游未知片段,最后通过PCR法扩增得到类枯草菌素蛋白酶基因片段。结果克隆得到1 519bp Pr1蛋白酶基因序列YP1977.DNAassist软件分析其中含有一个969bp的完整的开放阅读框,编码323个氨基酸,NCBI BlastX比对结果显示,该阅读框可能编码的氨基酸序列与多个物种的Pr1蛋白酶都具有较高的同源性。结论YP1977很可能是Pythium sp.CY1938菌株类枯草菌素蛋白酶Pr1基因的部分片段,但仍需要进一步通过构建表达系统加以验证。

新型抗菌肽——表面活性素、伊枯草菌素和丰原素

表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)和丰原素(fengycin)是一类主要由革兰阳性芽胞杆菌通过非核糖体合成途径产生的抗菌肽,一般是由1个β-羟基脂肪酸与7~10个氨基酸肽链以酰胺键连接而成的环肽,具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤等生物活性,具有良好的医疗应用前景。目前,人们对这3种新型抗菌肽在医药领域中的研究进展所知甚少,故本文对其发现历史、结构特点、作用机制、生物合成和应用价值进行阐述,为后续研究提供借鉴。

贵阳腐霉类枯草菌素蛋白酶基因的原核表达

目的:实现贵阳腐霉(Pythium guiyangense Su)类枯草菌素蛋白酶(subtilisin-like protease,Pr1)基因在大肠杆菌中的活性表达,验证已获得的基因序列(YP1977)是否属于subtilisin-like protease基因家族成员。方法:(1)提取贵阳腐霉总RNA,以已获得的序列(YP1977)为模版设计引物,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增Pr1基因ORF片段;(2)构建含有Pr1基因ORF序列、绿色荧光蛋白基因ORF序列的重组质粒pTWIN1-Pr1-EGFP,转化表达菌株E.coliER2566,IPTG诱导菌株表达Pr1蛋白酶。结果:成功构建含有Pr1基因ORF序列、绿色荧光蛋白ORF序列的重组质粒pTWIN1-Pr1-EGFP,实现了Pr1基因在大肠杆菌中的活性表达。结论:证明已获得的DNA序列是贵阳腐霉的一个Pr1基因的编码区。

伊枯草菌素研究进展

伊枯草菌素(iturin)是由枯草芽孢杆菌产生的一种具有环脂肽结构的两亲化合物,其中伊枯草菌素A应用最为广泛。它具有溶血、表面活性和强烈的抗真菌特性,并且具有抗菌谱广、低毒、低残留和低过敏性的特点,其抗菌机制是同时作用于病原菌的细胞壁和细胞膜,是一种潜在的具有极大开发应用价值的生物农药。该文综述了伊枯草菌素的应用、作用机理及发酵研究方面的进展。

菜籽粕直接发酵和生物预处理后发酵产伊枯草菌素A性能比较研究

以一株产伊枯草菌素A的枯草芽孢杆菌为研究对象,对比考察了菜籽粕直接发酵和生物预处理后发酵伊枯草菌素A的表达差异,在此基础上进一步考察了不同碳氮源对伊枯草菌素A表达的影响。研究结果表明:菜籽粕经黑曲霉和米曲霉固态发酵及自溶预处理后,游离氨基氮质量浓度得到大幅提升,其发酵起始质量浓度分别是菜籽粕直接发酵的8.7倍和5.6倍;菜籽粕直接发酵下伊枯草菌素A的表达水平明显高于经黑曲霉和米曲霉预处理后发酵的水平,最高质量浓度达0.69 g/L,且高于以商业化蛋白胨和酵母粉作为氮源时的最高水平;相对于其他可溶性碳源而言,低水溶性缓释碳源麸皮和玉米皮更有利于伊枯草菌素A的表达,当以麸皮作为碳源时,其最高质量浓度达到0.96 g/L,是葡萄糖作为碳源时的1.6倍。

氨基酸补料对伊枯草菌素A发酵的影响

对枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis ZK8)进行4种不同工艺(分批发酵和3种氨基酸浓度的补料-分批发酵)的发酵,测定并分析了发酵过程中各时间点样品中菌量、伊枯草菌素A(iturin A)的效价、还原糖、总氮及16种游离氨基酸的含量及变化趋势。结果表明,在工艺2(补料浓度分别为天冬氨酸55mg/L,谷氨酸12mg/L,脯氨酸6mg/L)发酵条件下,枯草芽胞杆菌ZK8菌量最高,达2.163×1010个/mL,比分批发酵(对照组)提高9.5%;在工艺1(补料浓度分别为天冬氨酸50mg/L,谷氨酸9mg/L,脯氨酸5mg/L)发酵条件下,iturin A效价最高,达20 101.1U,比对照提高了93.94%。

源自螺旋藻渣枯草芽孢杆菌发酵抗菌肽SP-AP-1和伊枯草菌素对金黄色葡萄球菌抑菌机制对比研究

目的:研究枯草芽孢杆菌发酵螺旋藻渣的发酵液中分离出的抗菌肽SP-AP-1和伊枯草菌素对金黄色葡萄球菌的抑菌机理。方法:采用紫外分光光度法、邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷法和原子吸收光谱法研究抗菌肽对金黄色葡萄球菌细胞膜通透性的影响;采用考马斯亮蓝法、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳考察抗菌肽对金黄色葡萄球菌胞内蛋白合成及对基因组DNA结合作用的影响,并通过模拟细胞膜的疏水环境探究抗菌肽发挥抑菌作用时其二级结构的变化情况。结果:抗菌肽SP-AP-1和伊枯草菌素均能引起金黄色葡萄球菌细胞膜通透性增加,导致胞内钾离子释放量、蛋白质泄漏量及细胞膜疏水性增加,但抗菌肽SP-AP-1的抑菌效果更为显著(P<0.05);两种抗菌肽均能抑制菌体蛋白合成,尤其对分子质量为17、20、25~35 kDa的蛋白抑制作用最为明显;虽然两种抗菌肽对金黄色葡萄球菌基因组DNA没有明显阻滞作用,但增大抗菌肽质量浓度,SP-AP-1可与溴化乙锭竞争性结合DNA,使基因组DNA条带变暗,影响蛋白质的表达。本实验为螺旋藻渣抗菌肽拮抗金黄色葡萄球菌的抑菌机理研究提供了理论参考。

解淀粉芽孢杆菌ZM9液体发酵伊枯草菌素A培养基优化

运用单因子实验法和正交实验法,得到解淀粉芽孢杆菌ZM9液体发酵伊枯草菌素A的优化培养基为:豆粕80 g/L,玉米淀粉30 g/L(液化处理),KH2PO41 g/L,Mg SO40.5 g/L,Fe SO40.15 g/L,Mn SO40.05 g/L,伊枯草菌素A的产量为3.37 g/L,较出发培养基产量2.19 g/L提高了53.88%。

伊枯草菌素A发酵过程中游离氨基酸的HPLC分析

建立一种快速、高效测定游离氨基酸含量的异硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生高效液相色谱法,并利用此方法分析检测iturin A发酵过程中游离氨基酸的动态变化。以异硫氰酸苯酯(PITC)为衍生化试剂,采用Venusil-AA(4.6 mm×250 mm,5μm)氨基酸分析专用柱,并优化HPLC检测色谱条件。结果表明:梯度洗脱程序、流动相pH值、色谱柱温对分析时间、色谱峰分离及峰型具有重要影响。当最优色谱条件为:流动相A为0.1 mol/L无水乙酸钠缓冲溶液(pH6.4±0.1)-乙腈(66∶5),流动相B为乙腈-水(4∶1),流速1.0 mL/min,检测波长254 nm,色谱柱温40℃,梯度程序洗脱,35 min内可完全分离16种氨基酸,且各氨基酸在一定浓度范围内线性关系良好(R2均大于0.9986),加标回收率在83.84%-108.02%之间,RSD值均小于2.77%。该方法耗时短、操作简便、准确可靠,具有良好的精密度和稳定性。通过此方法研究分析伊枯草菌素A发酵过程中各游离氨基酸含量变化规律,发现其氨基酸浓度变化规律大致分为三类。

伊枯草菌素类抗菌肽抑菌活性及机理研究进展

伊枯草菌素(iturin)家族是一类由革兰阳性芽孢杆菌通过非核糖体途径合成的抗菌肽,为脂肪酸与肽链组成的环肽,具有广谱抗菌活性、低过敏性及低毒性等特点。自发现以来,人们在此抗菌肽抑菌活性研究中收获颇丰,但对其抑菌机理知之甚少。本文从结构特点、体内外合成及抗菌活性等方面,总结了伊枯草菌素类抗菌肽表现的抑菌特征,为今后抑菌机理的揭示提供借鉴。

伊枯草菌素A对草莓腐败菌的抑制效果研究

实验研究了伊枯草菌素A对草莓腐败菌镰刀霉(Fusarium fujikuroi)和灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)的抑菌效果。实验采用脱氢乙酸钠和纳他霉素为阳性对照。研究结果得出,对F.fujikuroi,脱氢乙酸钠、纳他霉素、伊枯草菌素A的最低抑菌浓度(MIC)分别为3.0、7.5、0.0518 mg/mL;对B.cinerea,脱氢乙酸钠、纳他霉素、伊枯草菌素A的MIC分别为20、20、0.0370 mg/mL。上述结果表明,F.fujikuroi和B.cinerea对伊枯草菌素A的敏感性均大于脱氢乙酸钠和纳他霉素。对三种抑菌剂处理后的腐败菌进行核酸蛋白质泄露情况测定。结果表明,三种抑菌剂均是以破坏腐败菌的细胞膜,导致核酸蛋白质的泄露,从而达到抑菌效果。本文研究了伊枯草菌素A对采后草莓腐败真菌的抑菌效果,为伊枯草菌素A在草莓采后保鲜中的应用提供理论依据。

伊枯草菌素A高产菌株的筛选鉴定及发酵工艺研究

该研究采用平板对峙法及高效液相色谱(HPLC)法从土壤中筛选高产伊枯草菌素A(iturin A)的菌株,通过分子生物学技术对其进行菌种鉴定,并以iturin A产量为评价指标,对培养基成分及发酵条件进行研究。结果表明,筛选得到1株高产iturin A的菌株,编号为ND,并鉴定其为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis);其产iturin A的最佳培养基成分为豆粕粉120 g/L、酵母浸粉16 g/L、L-谷氨酸钠1 g/L、甘油70 mL/L、MgSO_(4)·7H_(2)O 0.5 g/L、KH_(2)PO_(4)1.0 g/L,FeSO_(4)·7H_(2)O 0.15 mg/L、MnSO_(4)·H_(2)O 5 mg/L、CuSO_(4)·5H_(2)O 0.16 mg/L;最佳培养条件为装液量12%、初始pH值8、接种量10%、培养温度28℃、培养时间5 d。在此最优条件下,菌株ND的iturin A产量为4.76 g/L,是优化前(0.35 g/L)的13.6倍。

特异性抑制肝细胞内前蛋白转化酶枯草菌素9合成的药物inclisiran治疗家族性高胆固醇血症开始Ⅲ期临床试验

Medicines公司宣布,可特异性抑制肝细胞内前蛋白转化酶枯草菌素9合成的英利西朗(inclisiran)治疗家族性高胆固醇血症开始Ⅲ期临床ORION-9试验。该试验是安慰剂对照、双盲、随机研究,评价英利西朗钠300 mg皮下给药,治疗482名家族性高胆固醇血症、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)升高且用他汀类或依西替米(ezetimibe)最大耐受剂量低的LDL-C患者。主终点为治疗17个月后,LDL-C较基线水平变化率。次终点包括LDL-C水平较基线的平均绝对变化,以及其他脂类和脂蛋白的变化。试验在8个国家54个医疗点中进行,每名患者皮下给药300 mg,在3个月及其后每6个月再给药1次,均伍用最大耐受剂量他汀类或依西替米治疗。

前蛋白转化酶枯草菌素9在心力衰竭中的研究进展

心力衰竭是一种慢性、进行性的临床综合征,其特征在于健康状况和剩余寿命逐步下降。尽管心衰的药物和非药物治疗均取得了重大进展,但心衰住院的经济负担仍然很高,并导致心衰相关的发病率、死亡率和医疗保健支出率过高。因此迫切需要在出现明显的临床症状和体征之前,识别有风险的心衰群体。前蛋白转换酶枯草杆菌9(PCSK9)被证明是调节低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的关键因子,是血脂治疗的靶点。随着临床对PCSK9的生物学功能深入研究,发现PCSK9在心血管疾病中可能具有除调节血脂代谢之外的其他功能。有研究表明,PCSK9水平升高可促使细胞过度自噬和凋亡,从而导致心功能不全。PCSK9还可能通过调节脂肪酸代谢和心肌收缩功能的作用,参与心力衰竭的病理生理过程。本文就PCSK9与心力衰竭之间关系做一综述。