用锅柄聚合酶链反应法克隆卡地腐霉Pr1基因的未知片段(英文)

目的:分离和克隆灭蚊真菌卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因已知片段的3′端未知序列。方法:采用 PANHANDLEPCR,以基因组DNA为模板,通过链内退火及延伸形成一个类似锅柄形状的结构,经嵌套式PCR 扩增得到未知目的片段。通过已知cDNA片段设计引物,PCR扩增得到该蛋白酶部分基因组序列,采用限制性 内切酶BamHⅠ消化卡地腐霉基因组DNA,经去磷酸化处理后,在消化片段3′端连接一段与卡地腐霉类枯草杆 菌蛋白酶基因5′端已知序列互补的5′端磷酸化寡核苷酸链NA,经链内退火及聚合酶延伸形成一锅柄状结构。 结果:获得一大小为876bp的PCR产物,经序列分析验证,该panhandlePCR产物包含了已知卡地腐霉类枯草杆 菌蛋白酶基因3′端未知的853bp核苷酸序列。结论:这种特殊的PCR方法可以高度有效地克隆和鉴定已知片 段两侧的未知基因片段。