广西产区柑桔溃疡病和柑桔全爪螨同治降本增效技术研究

柑桔全爪螨(俗称红蜘蛛)和柑桔溃疡病是广西沃柑生产上防控用药量最大的两种病虫害。为探索同时防治这两种病虫害的综合技术方案,从而达到降本增效的目的,设计了99%矿物油乳油∶77%氢氧化铜可湿性粉剂∶80%代森锰锌可湿性粉剂=5∶1∶2混配的“油铜锰方案”,并且3—7月在田间开展丰田FT-18型背负式电动喷雾器人工喷雾、极目EA-30XP农业无人机常量飞防和推荐施药量减量30%飞防不同施药方式的对比试验。试验表明,采用“油锰铜方案”防治柑桔红蜘蛛和柑桔溃疡病时,常量飞防和减量飞防的防治效果不低于人工喷雾,有些时期甚至更好。“油锰铜方案”减量飞防对柑桔红蜘蛛的防治效果最高可达97.71%,对柑桔溃疡病的防治效果可达98.57%。“油锰铜方案”减量飞防可实现“一高三减”的效果,即每小时10×667 m^(2)的高施药工效、减少用水量94%、减少人工成本33.33%和减少农药使用量37.5%。“油锰铜方案”减量飞防能有效解决广西沃柑产区柑桔溃疡病、柑桔红蜘蛛“一病一虫”施药难、防治效果差和防治成本高的难题,可在地势平坦的柑桔产区大面积推广应用。

柑桔溃疡病菌PCR检测方法(引物)筛选

为准确检测柑桔溃疡病菌,减少检测过程中假阳性和假阴性结果,进而为农业执法部门和口岸一线检疫鉴定提供参考,采用已报道的14对常规PCR和实时荧光PCR引物/探针,对来自不同国家和地区的22株柑桔溃疡病菌及9株黄单胞菌属其他菌株进行了特异性测试和灵敏度比对分析,对优选引物采用9份具柑桔溃疡病症状的样品进行检测验证。结果表明,引物对JYF5(XccF05)/JYR5(XccR05)和Xac01/Xac02的检测特异性高,对柑桔溃疡病菌DNA的检测灵敏度均为3 pg/μL;其他12对引物/探针会出现不同程度上的假阳性或假阴性,其中,XAcF/XAcR对来自泰国的酸橙样品和阳性菌株进行检测均为假阴性。推荐JYF5(XccF05)/JYR5(XccR05)和Xac01/Xac02这2对引物用于柑桔溃疡病菌的检测。

柑桔溃疡菌的共振散射光谱

研究了柑桔溃疡菌的共振散射光谱，在 330、 425、 465和 695 nm产生四个共振散射峰 .当激发波长为 330 nm（ 9.09× 1014 Hz）时，溃疡菌溶液在 330 nm（ 9.09× 1014 Hz）、 660 nm（ 1/2× 9.09× 1014 Hz）和 990 nm（ 1/3× 9.09× 1014 Hz）分别产生一共振散射峰和 1/2、 1/3两个分频散射峰；当激发波长为 465 nm（ 6.45× 1014 Hz）时，在 456 nm(6.45× 1014 Hz)和 930 nm(1/2× 6.45× 1014 Hz)分别产生一个共振散射峰和一个 1/2分频射峰 ;当激发波长为 930 nm(3.23× 1014 Hz)时 ,在 930 nm (3.23× 1014 Hz)、 620 nm(3/2× 3.23× 1014 Hz)、 465 nm(2× 3.23× 1014 Hz)和 310 nm (3× 3.23× 1014 Hz)分别产生一个共振散射峰，一个 3/2分频共振散射峰，一个 2倍频共振散射峰和一个 3倍频共振散射峰 .柑桔溃疡菌是一种非线性散射光学介质 .分频散射和倍频散射峰与共振散射峰具有相似的散射行为 .

柑桔溃疡病菌滚环扩增检测体系的建立

根据柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri,Xac)独有的蛋白基因序列和锁式探针公共连接序列分别设计特异性的锁式探针及其扩增引物,优化系列反应条件,建立了特异性的柑桔溃疡病菌滚环扩增体系。初步检测结果表明该体系能够特异性地检出Xac的菌体细胞及其DNA,而检测不出供试的其它植物病原细菌和柑桔叶面常见的多种附生细菌;对Xac靶片段克隆质粒DNA的检测灵敏度为102copy/μL,对Xac菌悬液的检测灵敏度为20cfu/μL,比常规PCR的检测灵敏度稍高。用滚环扩增技术和常规PCR技术对田间采集的实际样品进行了检测,两种方法的检测结果没有显著差异(P>0.01)。由于锁式探针的公共连接序列对扩增的条件要求一致,本体系的建立可以为植物病原微生物多靶标检测和病害检疫检验提供新的技术支撑。

3种杀菌剂对柑桔溃疡病菌的室内毒力测定

为筛选防治柑桔溃疡病的高效药剂,将23种常见商品杀菌剂分别稀释成200 mg/L,采用喷雾法进行室内抑菌试验,选择3种初筛抑菌效果较好的药剂进行室内毒力测定。结果表明,噻霉酮、农用链霉素、溴菌腈的抑菌效果较好,其EC50分别为46.59、86.18、102.91 mg/kg,噻霉酮的毒性最强。结合供试药剂有效成分和作用机理的比较,确定农用链霉素效果最佳。

柑桔溃疡病防治药剂的筛选研究

对24种药剂进行柑桔溃疡病菌的室内毒力筛选。结果表明,噻霉酮、溴菌腈和农用链霉素的抑菌效果较好。选择噻霉酮、溴菌腈、农用链霉素、菌立清、松脂酸铜、甲基硫菌灵.异菌脲等10种药剂进行田间药效试验,春雷霉素400倍液(防效78.63%)、噻霉酮900倍液(防效77.01%)、琥胶肥酸铜600倍液(防效73.46%)、农用链霉素1 000倍液(防效72.77%)对柑桔溃疡病防治效果较好,推荐生产上使用生物制剂春雷霉素及农用链霉素。

柑桔溃疡病生防细菌Bt8的研究

柑桔溃疡病是中国柑桔的重要病害。从南宁柑桔园土壤中分离到1株对柑桔溃疡病菌具有强抑制力的细菌Bt8。根据Bt8菌株的形态1、6S rDNA序列分析以及生理生化特性,将其鉴定为鲍氏不动杆菌。Bt8菌株的抑菌效果受温度、pH及培养基等环境因素的影响。在温室条件下将该细菌悬浮液喷施到柑桔叶片上,获得了55.2%的病斑抑制效果。研究结果揭示了鲍氏不动杆菌在柑桔溃疡病田间防治上的潜能。

拌种灵对柑桔溃疡病菌菌体细胞活性的影响

通过对柑桔溃疡病菌菌体细胞的药理学研究表明 ,拌种灵对病原菌的生长具有较高的抑制作用 ,其有效抑制中浓度 (EC50 )为 2 6 2 5 7μg·mL-1,这种抑制作用在病原菌生长的不同时期具有很大差异。拌种灵对菌体细胞膜通透性没有影响 ,对细胞膜Na+ K+ ATP酶及其活化能、菌体蛋白合成及细胞呼吸作用等具有不同程度的影响。

几种杀菌剂对柑桔溃疡病的生物活性

为筛选防治柑桔溃疡病的有效药剂,按大田推荐使用浓度,用抑菌圈法测定17种非铜药剂和5种含铜药剂对柑桔溃疡病的毒力,并研究7种非铜药剂田间防治效果。结果表明,代森锰锌、福美双、福美双.溴菌腈、农用链霉素、金核霉素和琥胶肥酸铜.乙磷铝.硫酸锌抑菌作用最强,其次为福美双.福美锌、大蒜素、络氨铜.络氨锌和盐酸吗啉胍.乙酸铜,过氧乙酸、噻唑锌、春雷菌素、中生菌素、琥珀酸铜和噻菌铜有微弱的抑菌作用,百菌清、多菌灵、苯醚甲环唑、叶青双、复硝酚钠和井冈霉素无抑菌作用。大田试验结果表明,30%金核霉素WP 500 mg/L和72%农用链霉素WP 200 mg/L处理对柑桔溃病的防效分别为76.34%和74.94%,显著优于其它药剂处理;80%代森锰锌WP 2000 mg/L、50%福美双WP 400 mg/L和50%福美双.溴菌腈WP 500 mg/L处理对柑桔溃病的防效分别为70.36%、66.55%和69.37%,与对照含铜药剂20%噻菌铜SC 67 mg/L处理无显著差异;大蒜素和叶青双对柑桔溃病防效较差,6%大蒜素EC 120 mg/L和20%叶青双WP 400 mg/L处理对柑桔溃病的防效分别为41.84%和21.82%,显著低于对照含铜药剂20%噻菌铜SC 67 mg/L处理。

柑桔溃疡病内生拮抗细菌Bc51的研究

从中国南宁柑桔叶片中分离到对柑桔溃疡病菌有拮抗作用的细菌菌株Bc51。根据16S rDNA序列同源性、形态学特征和生理生化反应,将该菌株鉴定为洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)。温度、pH值和培养基对洋葱伯克霍尔德氏菌抑制柑桔溃疡病菌生长的能力有显著影响。在温室测试中,观察到60.3%柑桔溃疡病斑的形成受到洋葱伯克霍尔德氏菌抑制。连续8次在人工培养基上转代培养,洋葱伯克霍尔德氏菌对柑桔溃疡病菌生长的抑制力没有发生明显改变。洋葱伯克霍尔德氏菌对植物病原菌有较宽的抑菌谱,表明除柑桔溃疡病外,该菌对其它作物病害的防治也具有潜在的应用价值。

柑桔溃疡病菌致病性研究初探

从四川、湖北两省收集的柑桔病样分离出2个溃疡病菌株,经生物学和PCR鉴定后,分别针刺接种于纽荷尔脐橙、福本脐橙、卡拉卡拉脐橙和春见桔橙等4个柑桔品种;接种2 d后调查发病情况,使用DPS软件8.01的Duncan新复极差法进行分析。结果表明,接种后4 d是最佳观察时期,4个柑桔品种分别接种上述菌株后发病率无明显差异,老叶和成叶的发病率要高于嫩叶的发病率,叶片不同部位之间的发病率也基本相当,桔橙的抗病性要高于脐橙的抗病性。

柑桔溃疡病发生测报模型的建立

2001～2003年从田间系统调查了柑桔溃疡病发生、流行规律。采用DPS数据处理系统方法,建立了柑桔溃疡病发生流行测报模型,Yn=-33.832+1.193X1n+2.259X2n+0.008X3n,RY=0.959 。研究结果表明,病害发生流行与柑桔的物候期及雨量、雨日、温度的气候因素关系密切。其中,病害发生的严重度与雨量、雨日呈显著性相关,相关系数分别为R1=0.916 和R2=0.868 ,该测报模型能较准确地预测中短期柑桔溃疡病发生、流行程度。

应用PCR技术快速检测柑桔溃疡病的研究

应用PCR检测柑桔溃疡病,所用引物为5'TTGGTG TCGTCGCTTGTAT 3'和5'CACGGGTGCAAAAAATCT3'.从病样的叶片、果皮和枝皮抽提溃疡病菌的PCR扩增,其产物经琼脂粮凝胶电泳,产生大约220bp的特征条带,与纯培养溃疡病菌的PCR产物一致.试验比较两种核酸抽提方法,微量快速抽提法的灵敏度明显高于高盐抽提法.有症状病样品的不同部位均能检测到溃疡病;病株的无症状叶片、果皮、枝皮有部分检测到病菌.病果园健康植株大多数检测不到病菌,少数植株PCR产物电泳务带较弱.取样量以10～20mg为宜.该PCR技术可用于快速检测柑桔溃疡病.

AR模型在柑桔溃疡病测报中的应用

柑桔溃疡病发生程度的预测是进行该病治理的重要依据。本研究用自回归方法对2004年3月12日～2005年4月13日期间调查的病情原始数据进行标准化、平稳化处理以及模型的参数估计和拟合检验，所得AR（14）模型可以精确预测溃疡病发生趋势。

叶片微形态结构特征与柑桔溃疡病抗性的关系

为了研究叶片微结构特征与柑桔溃疡病抗性的关系,选择对柑桔溃疡病具有高抗(罗浮金柑)、抗(新生系3号椪柑)、耐(纽荷尔脐橙)和高感(星路比葡萄柚)特性的4个品种为试材,在室内涂抹接种验证抗病性的基础上,采用扫描电镜及树脂包埋半薄切片等技术对成熟叶片的解剖结构及下表皮进行观测,并采用细菌分离法测检各品种健康叶片浸泡接种病菌侵入数量。结果表明:4个品种对柑桔溃疡病抗性差异明显;叶片浸泡接种病菌侵入数量与品种抗性密切相关,依次为星路比葡萄柚>纽荷尔脐橙>新生系3号椪柑>罗浮金柑;不同品种的气孔密度、气孔大小、叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度和下皮层厚度存在差异,但是只有气孔密度与抗性之间能呈现出有规律的对应关系;气孔密度可作为柑桔植株抗柑桔溃疡病早期选择的辅助形态指标。

柑桔溃疡病生物防治研究

为减少柑桔溃疡病综合防治中化学农药的使用 ,提高柑桔产量和品质 ,对柑桔溃疡病的生物防治进行了研究 .从湖南衡阳等地采集不同品种的叶片、幼果 ,采用平板稀释分离法进行分离 ,共获得 35个分离菌株 .分别测定这些菌株对柑桔溃疡病病菌的拮抗作用 .结果表明 ,K- 2 ,K- 18两种细菌对柑桔溃疡病病菌有明显的拮抗效果 .无菌滤液的水合茚三酮反应结果表明 ,K- 18菌产生的抗生素中含有蛋白多肽类物质 .这两种拮抗细菌的培养液在温室和大田防治试验中对柑桔溃疡病表现出了良好的防治效果 .

创制农药噻唑锌对柑桔溃疡病的田间药效

噻唑锌是噻二唑类有机锌杀菌剂,对柑桔溃疡病有较好的防治效果。第一次药后13d和第二次药后20d调查结果表明,对柑桔叶片溃疡病,20%噻唑锌SC400～667ga.i./hm2的防治效果极显著高于77%氢氧化铜WP936ga.i./hm2,286ga.i./hm2处理防治效果与77%氢氧化铜WP936ga.i./hm2防治效果相当;对柑桔果实溃疡病,20%噻唑锌SC667ga.i./hm2的防治效果极显著高于77%氢氧化铜WP936ga.i./hm2,400ga.i./hm2的防治效果显著高于77%氢氧化铜WP936ga.i./hm2的防治效果,286ga.i./hm2防治效果与77%氢氧化铜WP936ga.i./hm2防治效果相当。生产上使用20%噻唑锌SC,推荐剂量为286～667ga.i./hm2,间隔10～15d,连续施药2～3次,对桔柑溃疡病有较好的防治效果。

抗柑桔溃疡病菌可溶性单链抗体的表达及鉴定

前期采用核糖体展示技术筛选了抗柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv. citri,Xac)高亲和力单链抗体(Single chain variable fragment,scFv)GX13、GX44和GX95,为高效表达具有生物活性的单链抗体,本研究将前期筛选的高亲和力单链抗体基因转入大肠杆菌HB2151中进行可溶性表达,点印迹和Western印迹检测可溶性单链抗体的表达水平,亲和层析纯化表达的单链抗体,酶联免疫吸附法(ELISA)检测纯化单链抗体的抗原结合活性.结果显示,3株抗柑桔溃疡病菌可溶性单链抗体在大肠杆菌HB2151中均获得成功表达,表达产物分子量(Mr)约为32.0×103,主要集中于细菌周质腔中.ELISA检测纯化的单链抗体都具备抗原结合活性,可进一步应用于柑桔溃疡病菌的免疫诊断和病害防治.

柑桔溃疡病菌胞外产物在拌种灵与菌体互作中的作用

柑桔溃疡病原细菌的胞外产物 ,在拌种灵与病原菌互作过程中具有一定的调控作用。胞外产物尤其是胞外粘多糖 ( EPS) ,对拌种灵具有很强的拮抗作用 ;经药剂处理的病原菌 ,其胞外产物如 :电解质、EPS、胞外蛋白、以及胞外水解酶等 ,其产量和生物活性都呈现出一定规律的变化。研究表明 ,病原菌在药剂处理下 ,可通过胞外产物的变化产生一定的抗逆反应。