浙江省柑橘绿霉病菌对嘧菌酯的敏感性研究

采用孢子萌发法和生长速率法测定了2000～2006年间采自浙江衢州、杭州、金华、丽水的65个柑橘绿霉病病菌Penicillium digitatum菌株对嘧菌酯的敏感性。结果表明：嘧菌酯对供试菌株孢子萌发和菌丝生长的EC50值均呈单峰分布，分别介于0．0201～0．2600μg/mL和0．0053—0．0794μg／mL之间，平均值分别为0．0426μg／mL和0．0250μg／mL。敏感性频次分析结果表明，该65个菌株孢子萌发和菌丝生长对嘧菌酯的敏感性频率分布均符合正态分布，其EC50平均值0．0426±0．0304μg／mL和0．0250±0．0129μg/mL可分别作为柑橘绿霉病菌孢子萌发和菌丝生长对嘧菌酯的敏感基线。

1株拮抗酵母菌对柑橘绿霉病菌的抑制作用

以柑橘绿霉病菌(Penicillium digitatum Sacc.)为供试材料,研究拮抗酵母菌(Kluyveromyces ma-rxianus)对柑橘采后绿霉病菌的抑制效果,并观察其对采后柑橘果实多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影响。结果表明:拮抗酵母菌的菌株悬浮液和培养原液对柑橘采后绿霉病菌均有较好的抑制作用,但菌株培养上清液和热杀死液对柑橘绿霉病菌的抑制效果较差;与对照相比,接种拮抗菌与病原菌能够诱导柑橘果实PPO、POD和PAL活性的升高;拮抗酵母菌对柑橘绿霉病菌的抑菌机制与营养和空间的竞争以及诱导抗病性相关酶有关。

浙江衢州地区柑橘绿霉病菌对抑霉唑和多菌灵的抗性水平及其分子机制

研究了采自浙江衢州地区,包括柯城区、衢江区和开化县12个贮藏库的70个柑橘绿霉病菌Penicillium digitatum菌株对抑霉唑和多菌灵的抗性频率、抗性水平及其抗性分子机制。结果表明:柯城区和衢江区的抑霉唑抗性菌株(最低抑制浓度MIC≥0.5μg/mL)的比例分别为77.1%和62.5%,两地抗性菌株的平均EC50值分别为2.07±1.04μg/mL和2.35±0.73μg/mL,分别是当地敏感菌株EC50值的41.4和47.0倍;而采自开化县的菌株均对抑霉唑敏感(MIC≤0.1μg/mL),平均EC50值为0.04±0.02μg/mL。柯城区和衢江区的多菌灵抗性菌株(MIC≥10μg/mL)的比例分别为54.3%和54.2%,而开化县的抗性菌株比例仅为9.1%。即来自柯城和衢江两个柑橘主产区的绿霉病菌群体对抑霉唑和多菌灵的抗性频率均远高于非柑橘主产区的开化县群体,说明抗药性群体的形成与药剂使用历史有关。进一步研究发现,衢州地区柑橘绿霉病菌对抑霉唑的抗性均属于IMZ-R3型,即与抑霉唑靶标基因CYP51B启动子区的插入突变有关,而对多菌灵的抗性则与β-微管蛋白基因的992位核苷酸点突变(T→A)导致对应的200位点的氨基酸突变(F→Y)有关。

柑橘绿霉病菌拮抗放线菌MY-5的筛选与鉴定

筛选拮抗活性菌株和寻找新的活性代谢产物,可为果蔬采后病害防治提供新的资源。此文主要研究广东省各地区水果园和蔬菜地采集土壤23份并分离获得放线菌212株。以柑橘绿霉病菌为目标菌,采用抑菌带测定法,筛选获得9株具有拮抗活性的放线菌菌株,其中菌株MY-5拮抗活性最强,抑菌带宽达18.67mm,同时对其它13种果蔬采后病害也有较强的拮抗作用。通过对菌株MY-5形态观察、培养特征观察、生理生化反应和16SrDNA鉴定,结果表明该菌株为链霉菌属吸水类群(Streptomyces hygroscopicus)。

海洋放线菌A3202发酵液对柑橘绿霉病菌的抑制活性测定

目前对柑橘绿霉病的防治主要以化学药剂为主,如咪唑类杀菌剂咪鲜胺和抑霉唑、双胍盐类杀菌剂百可得等。化学农药的长期大量使用除带来环境污染、食品安全等问题外,还易诱发病原菌产生抗药性。研究表明柑橘绿霉病菌已对咪鲜胺等杀菌剂产生了普遍的抗药性。

柑橘绿霉病菌对咯菌腈的敏感基线的建立

咯菌腈（fludioxonil）是高渗透压甘油响应信号途径的干扰剂,对多种植物病害具有很好的防治效果。该研究采用孢子萌发法和菌丝生长速率法测定了来自浙江衢州和江西赣南两地78个柑橘绿霉病菌（Penicillium digitatum）菌株对咯菌腈的敏感性。结果表明,咯菌腈抑制柑橘绿霉病菌孢子萌发和菌丝生长的EC50值分别为0.0285~0.11μg·m L-1和0.0019~0.04μg·m L-1,平均值分别为（0.0557±0.0041）μg·m L-1和（0.0118±0.0015）μg·m L-1。EC50值的频次分布符合偏正态分布,可分别作为柑橘绿霉病菌孢子萌发和菌丝生长对咯菌腈的敏感基线。

柑橘绿霉病菌中多聚半乳糖醛酸酶基因(PdPG2)的表达分析

柑橘绿霉病菌Penicillium digitatum是储藏期柑橘腐烂病最主要的病原之一,严重影响柑橘产业的发展。已有研究表明,柑橘绿霉病菌中多聚半乳糖醛酸酶(PdPG2)对其致病性有重要作用,PdPG2基因功能缺失突变株的致病性会下降,然而有关PdPG2基因的表达研究尚不完善。本文研究了PdPG2基因在不同条件下的表达情况,结果表明PdPG2是酸性表达基因,其表达量随着pH的升高而降低,pH为3.0时其表达量为对照条件下的10倍,pH为8.0时其表达量为对照条件下的0.36倍。柑橘果胶能够诱导PdPG2的表达,其表达量为对照的3.6倍。因此,在侵染过程中PdPG2表达的升高是由于发病部位酸化以及橘皮降解物诱导共同引起的。

柑橘绿霉病菌木聚糖酶基因(PdXY2)功能初步研究

柑橘绿霉病菌(Penicillium digitatum)是引起柑橘储藏期腐烂最主要的病原之一,严重影响了柑橘产业发展。本试验克隆了柑橘绿霉病菌的木聚糖酶基因(PdXY2),对其表达进行研究,在柑橘发病过程中,PdXY2的表达显著升高,至48h达到最高,其表达量为对照的4倍。为进一步明确PdXY2基因功能,构建了PdXY2基因缺失突变株(ΔPdXY2),ΔPdXY2突变株的致病性与野生型相比没有明显差异。由此我们推断,在柑橘绿霉病菌侵染柑橘的过程中PdXY2有一定的作用,但是单一缺失木聚糖酶PdXY2基因不能影响其致病性。

柑橘绿霉病拮抗细菌的筛选及其抑制效果

从根际土壤中筛选出1株对柑橘绿霉病菌Penicillium digitatum Sacc.具有较强拮抗活性的菌株HA-01。采用平板对峙法,测定了该菌株对柑橘绿霉病菌、柑橘青霉病菌Penicillium italicum、柑橘酸腐病菌Geotri-chum candidum等12种果蔬病原菌的拮抗活性。结果表明,菌株HA-01对12种供试病原菌均有不同程度的拮抗作用,表现出广谱抗菌活性。菌落形态观察、生理生化特性分析、16S rDNA序列同源性比对以及特异性PCR检测结果表明,该菌株为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。对马水橘的活体接种试验表明,菌株HA-01的发酵液、菌悬液和发酵滤液处理3 d后柑橘绿霉病的发病率均低于20%,病斑直径均在2.00 cm以下,而对照发病率为94.44%,病斑直径为3.60 cm。

柑橘绿霉病菌基因功能研究进展

柑橘绿霉病是柑橘采后腐烂最主要的原因之一,随着分子生物学技术的发展,对病原真菌的研究己从形态表型的观察检测发展到了对基因功能的深入研究。本文对柑橘绿霉病菌基因组分析及致病性、杀菌剂抗性和其它生物学性状相关基因功能的研究进展进行了综述,并讨论了未来的研究方向。

外源NO诱导下MAPK基因在采后柑橘果实抗绿霉病中的表达分析

一氧化氮(NO)是植物逆境响应的重要信号分子,能够诱导激活丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)的活性。为了分析外源NO诱导下MAPK基因在采后柑橘果实抗绿霉病中的表达情况,以埃及糖橙(Citrus Sinensis)果实为材料,使用硝普钠(SNP)溶液处理果实,统计接种柑橘绿霉病菌后果实的发病率和病斑面积,荧光定量PCR检测果实中MAPK基因的相对表达量和变化趋势。结果表明:外源NO能够降低试验期间柑橘果实绿霉病的发病率;果皮中MAPK基因的表达受外源NO诱导;CsMAP1、CsMAP15和CsMAP13-like基因在NO处理1 h即受诱导表达,CsMAP、CsMAP9、CsMAP9-like、CsMAP13-like、CsMAP19-like和CsMAP20-like在NO处理4 h达到表达高峰,CsMAP4-like、CsMAP7和CsMAPNTF3在NO处理12 h达到表达高峰,CsMAP1、CsMAP15、CsMAPMMK1和CsMAPMMK2分别在NO处理4 h和12 h有两个表达高峰。说明外源NO提高了柑橘果实对绿霉病的抗性,果皮中MAPK基因的诱导表达可能在抗病中发挥作用。

柑橘内生放线菌CR20的鉴定与拮抗活性

从不同橘园取不同柑橘品种的根部,共分离获得42株内生放线菌,经抑菌试验,筛选到1株对柑橘绿霉病菌和青霉病菌具有较高拮抗活性的放线菌菌株,将其编号为CR20。通过对菌株形态学特征和生理生化特性的观察,并结合对其16S rDNA的序列分析,将菌株CR20初步鉴定为弗吉尼亚链霉菌。

指状青霉V-ATP酶H亚基蛋白的功能

目的:通过基因干扰和过表达技术,研究V-ATP酶H亚基(V-ATPase membrane subunit H,VMAH)蛋白在柑橘绿霉病菌指状青霉生长中的生理功能,及其作为抗柑橘绿霉病药物作用靶点的可行性。方法:采用菌丝生长法和孢子萌发法,研究沉默和过表达VMAH基因对正常和胁迫条件下指状青霉细胞生长特性的影响。结果:在正常生长条件下,沉默VMAH基因显著抑制了指状青霉菌丝体的生长;而过表达VMAH基因对菌体生长表现出显著促进作用。在不同pH值环境下,沉默VMAH基因显著抑制了指状青霉菌丝的生长,尤其在偏酸性(pH值低于2)和偏碱性(pH值高于8)条件下尤为显著;而过表达VMAH基因在一定程度上促进了菌体菌丝的生长,pH值为6时,其促进作用最显著。与野生株相比,沉默VMAH基因对胞外Ca^(2+)、Cu^(2+)、Fe^(2+)等金属离子胁迫处理较为敏感。VMAH基因沉默菌株对质子泵抑制剂类杀菌剂的敏感性显著增加,尤其V-ATP酶专一性抑制剂巴佛洛霉素A_(1)最为明显;而VMAH基因过表达菌株对质子泵抑制剂类杀菌剂的敏感性显著降低。结论:VMAH在指状青霉生长过程中发挥重要作用,是研发低耐药性柑橘采后杀菌剂的潜在作用靶点。

四株虫生真菌代谢产物对植物真菌性病害的抑制作用

采用十字交叉法测定4株虫生真菌代谢产物对小麦纹枯病菌(Ceratobasidium cornigerum)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、葡萄炭疽病菌(Glomerella cingulata)、梨黑斑病菌(Alternaria kikuchiana)、柑橘绿霉菌(Penicillium digitatum)的抑菌作用。结果表明,4株虫生真菌代谢产物对5种植物真菌性病害菌落生长均有一定的抑制作用,其中以卵胞白僵菌(Beauveria brongniartii)菌株BE-1对5种供试植物病原真菌菌落生长的平均抑制率最高。表明利用虫生真菌代谢产物对开发抗植物病原菌活性物质具有较大的开发潜力,值得进一步深入研究。

柑橘的防腐保鲜贮藏处理

柑橘上应用的防腐利主要有苯并咪唑类如特克多、苯来特、多菌灵、托伽沛和叩蟮托布津等，使用浓度一般为500～1000mg／L。目前已在多个地区发现抗苯并咪唑类药剂青绿霉病菌菌系。其它还有抑霉唑（伊迈唑）和仲丁胺。