柑橘褪绿矮缩病毒dot-ELISA检测方法的建立及应用

【目的】柑橘褪绿矮缩病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDaV)是一种新的柑橘病毒,为给我国柑橘脱毒苗木质量控制和田间监测提供技术支撑,建立了一种灵敏度高、特异性强的快速检测方法。【方法】通过序列分析和相似性比对,明确抗原靶标;构建CCDaV-CP的原核表达载体,诱导目的蛋白表达后作为抗原用于注射兔子,制备抗血清。运用Western blot检测效价。通过优化抗体浓度,建立CCDaV的dot-ELISA检测方法,明确其灵敏度,并用于田间疑似样品检测。【结果】以外壳蛋白(CP)的保守区域为靶标,成功构建了表达载体pET28a-CCDaV-CP,其在18℃,IPTG浓度0.5 mmol·L^(-1)时,诱导12 h,目的蛋白的表达量高。制备的特异性抗血清效价为1:3000。由此建立的dotELISA检测方法在提取液被稀释640倍时,仍能检测出CCDaV。应用该方法对42份田间疑似样品的检测结果与PCR法的符合率为94.73%。【结论】首次获得了CCDaV的抗血清,并以此建立了快捷、灵敏、准确的dot-ELISA检测方法,为CCDaV的快速检测和防控提供了技术支撑。

重庆柑橘产区柑橘褪绿矮缩病毒的发生、分布和分子特性研究

【目的】明确柑橘褪绿矮缩病(Citrus chlorotic dwarf-associated virus, CCDaV)在重庆柑橘产区的发生、分布和分子特性,为制定有效防治措施提供理论基础。【方法】对采自重庆的361份疑似感染褪绿矮缩病的柚类和柠檬样品进行CCDaV检测鉴定,通过背靠背引物扩增获得CCDaV的全序列,进而分别使用RDP4和SDTv.1.2进行重组和相似性分析,并采用邻接法构建系统发育树。【结果】在3份红宝石柚(Citrus paradisi)样品中检测出了CCDaV,其全长分别为3642、3640和3641 bp。全基因组分析未发现重组事件,且上述3个CCDaV毒株与已知41个CCDaV毒株的核苷酸和氨基酸相似性分别为99.1%~99.7%和97.3%~99.7%。系统进化树分析显示,本研究中CCDaV毒株被分为了4个不同的类群,其中巫溪样品WX-4-6和WX-4-9,与广东沙田柚上的CCDaV毒株聚在一簇;而巫溪样品WX-2-5与中国柚类上获得的CCDaV毒株聚于另一个分支。【结论】在重庆首次发现了CCDaV,可能是随带病苗木进入。