柑橘黄脉病毒一步法RT-PCR快速检测技术探究

本研究通过对柑橘黄脉病毒(citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)的三基因盒基因、病毒外壳蛋白基因及23 K基因序列分析并设计出7对引物,对引物特异性和灵敏度进行比较,筛选出能够应用于实验室一步法RT-PCR快速检测CYVCV的引物,由此建立起针对CYVCV一步法RT-PCR快速检测体系。结果表明:引物对TGB1-F/R能从柑橘总RNA稀释160000倍(0.004 ng·μL^(-1))的稀释液中检测出CYVCV,利用该体系对607份田间随机样品进行检测,CYVCV的感染率为10.05%,说明该体系可靠稳定,适用于实验室里的大量检测;一步法RT-PCR获得CYVCV的TGB1、TGB2、TGB3、CP和23 K的特异性片段,片段序列长度分别为678、327、183、978和669 bp,通过克隆和测序结果比对显示,各片段与已报道的CYVCV病毒序列具有较高的同源性,同源性均在99%以上。

广西柑橘衰退病和黄脉病调查及其病原病毒的遗传多样性分析

为明确柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)和柑橘黄脉病毒(citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)在广西柑橘上的发生、分布及其遗传变异情况,于2020年至2021年对百色、北海、崇左、贵港、桂林、河池、贺州、来宾、柳州、南宁、梧州和玉林等12个柑橘产区进行了病毒病调查。采用RT-PCR对采集样品进行了病毒检测,并基于病毒分离物外壳蛋白(coat protein,CP)基因的核苷酸序列进行比对分析,构建系统发育树。结果表明:采集的737份柑橘样品中,CTV的检出率为20.62%,CYVCV检出率为18.32%,CTV的检出率略高于CYVCV。病毒复合侵染的现象在采集的柑橘样品中普遍存在,CTV和CYVCV复合侵染率高达34.50%。对RT-PCR产物测序共获得12个CTV分离物和6个CYVCV分离物的CP基因序列。遗传多样性分析发现,CTV和CYVCV的CP基因序列都较保守,CTV分离物的遗传进化与地理来源、寄主来源均没有明显相关性,但CYVCV分离物的遗传进化与地理位置具有相关性,而与寄主来源无明显相关性。上述研究结果可为深入了解CTV和CYVCV在广西的流行情况以及柑橘病毒病的检疫和防控提供参考。

亚洲柑橘木虱中柑橘黄脉病毒的鉴定

柑橘黄脉病毒(citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)为正单链RNA病毒,属于α线性病毒科Alphaflexiviridae印度柑橘病毒属Mandarivirus成员,病毒粒子为弯曲线状,基因组大小约为7529 nt[1]。CYVCV可侵染大部分柑橘品种,对柠檬和酸橙危害尤为严重。CYVCV 2009年在我国首次发现,现已在我国柑橘主产区均有发生,已知的传媒昆虫为柑橘粉虱(Dialeurodes citri)和棉蚜(Aphis gossypii)[2-4]。

浙江柑橘产区柑橘黄脉病毒的发生、分布与分子特性研究

运用RT-PCR技术对采自浙江12个柑橘产地的181份柑橘样品进行检测,首次从浙江的‘佛手’柑(Citrus bergamia)和‘红美人’橘(C.reticulata)上检测出柑橘黄脉病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV),其检出率分别为68.0%和47.2%。选取4个CYVCV毒株与11个已知CYVCV毒株进行全序列分析,结果显示CYVCV序列保守性较高,所有15个CYVCV毒株的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为96.9%~99.8%和97.9%~99.4%。虽然采自浙江的4个CYVCV毒株在进化树中聚成单独的簇,但CYVCV毒株间的亲缘关系可能不与其采样地的存在相关性。

柑橘黄脉病毒侵染对柠檬光合特性和叶绿体超微结构的影响

以3年生尤力克柠檬实生苗为试验材料,嫁接柑橘黄脉病毒(CYVCV)现症后,测定叶片的叶绿素含量、叶绿素荧光参数、光合参数和酶活性。与健康植株相比,病株中叶绿素含量(Chl)、净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、潜在光化学效率(Fv/Fo)和最大光化学效率(Fv/Fm)较对照植株显著降低,初始荧光(Fo)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量显著增高,过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性无显著变化,透射电镜观察发现其叶绿体因淀粉粒增多而肿胀变大,基质和基粒片层松散,嗜锇颗粒增多。CYVCV侵染破坏了尤力克柠檬的叶绿体结构,严重影响叶片的光合作用能力,进而引起植株生长受阻。

不同类型柑橘中黄脉病毒衣壳蛋白基因的保守性及复制水平

为研究不同柑橘品种对柑橘黄脉病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)变异的影响,将CYVCV毒株CQ01嫁接接种于4类共35个柑橘品种,对不同植株中CYVCV的衣壳蛋白(CP)基因进行分析,结果发现仅有少数位点发生了变异。运用RT-qPCR技术检测不同柑橘品种中CYVCV的相对含量,发现甜橙类品种中CYVCV的相对含量最高,墨西哥来檬中CYVCV的相对含量最低。植株中CYVCV的含量与其症状不存在明显的关联。