柑橘黑斑病菌的分子检测技术研究

为了快速区分柑橘黑斑病菌、亚洲柑橘叶点霉菌、首都叶点霉菌和中国柑橘叶点霉菌,在ITS1和18S区域设计了针对柑橘黑斑病菌、首都叶点霉菌和中国柑橘叶点霉菌的上游引物,以ITS4作为下游引物,并对所设计引物的特异性和退火温度进行了筛选,对引物的灵敏度进行了验证,并进行了果园疑似病斑的检测。结果表明,在退火温度为60℃时,引物Pc1/ITS4仅能从柑橘黑斑病菌中扩增出593 bp的特异性条带,引物Pct4/ITS4仅能从首都叶点霉菌中扩增出551 bp的条带,引物Pcc1/ITS4仅能从中国柑橘叶点霉菌中扩增出706 bp的条带,不能从柑橘常见病害病原菌中扩增出任何条带。特异性引物的灵敏度检测结果表明,引物Pc1/ITS4和Pct4/ITS4的检测灵敏度为200 pg,引物Pcc1/ITS4的检测灵敏度为20 pg。筛选的特异性引物Pc1/ITS4可以对果园疑似柑橘黑斑病病斑进行检测。因此,利用设计的特异性引物Pc1/ITS4、Pct4/ITS4和Pcc1/ITS4,结合简单的病原菌基因组DNA提取方法,可以在短时间内完成对病原菌的分子检测。

柑橘黑斑病菌与柚黑斑病菌对苯并咪唑类杀菌剂的抗性及其分子机制

为了对柑橘黑斑病和柚黑斑病提出更科学的化学防治方法,该文研究了柑橘黑斑病菌和柚黑斑病菌对杀菌剂多菌灵的抗性频率、抗性水平及其抗性分子机制。结果表明:在江西114个柑橘黑斑病菌株中发现了2个多菌灵抗性菌株,抗性频率为1.75%,抗性系数分别为5333.6和379.2;在四川32个柑橘黑斑病菌株中发现了1个多菌灵抗性菌株,抗性频率为3.13%,抗性系数为303.3;在浙江23个菌株和重庆3个菌株中没有出现抗性菌株。在广东收集的54个柚黑斑病菌株中发现了1个抗性菌株,抗性频率为1.85%,抗性系数为13719.5;在广西和福建分别收集的34个柚黑斑病菌株中没有发现抗性菌株。柑橘黑斑病菌和柚黑斑病菌对甲基硫菌灵和多菌灵存在正交互抗性,对嘧菌酯和多菌灵无交互抗性。因此,建议多菌灵可继续在柑橘黑斑病和柚黑斑病防治中使用,鉴于高抗菌株已出现,使用时应与其他作用机制的杀菌剂轮换使用。本实验还发现,柑橘黑斑病菌存在2种抗苯并咪唑类的分子机制,即β-微管蛋白基因上第198位氨基酸位点由谷氨酸突变为赖氨酸(抗性系数为5333.6的菌株)和第200位氨基酸位点由苯丙氨酸突变为酪氨酸(抗性系数为379.2的菌株);而柚黑斑病菌抗苯并咪唑类的分子机制则与β-微管蛋白基因第198位氨基酸由谷氨酸突变为丙氨酸有关。

柑橘叶点霉属(Phyllosticta spp.)真菌的遗传多样性分析

利用筛选的11条ISSR引物对从我国柑橘主产区和国外收集的135株叶点霉属真菌菌株进行扩增,扩增产物进行凝胶电泳,扩增图谱用NTSYS-pc2.10软件进行群体聚类分析。结果显示,共扩增出116个DNA条带,其中多态性位点为112个,多态率为96.55%;平均每个引物可以扩增出10.55个条带,扩增产物大小在250~3 000 bp。聚类分析显示,中国柑橘叶点霉属真菌可以分为4个种,即P.citricarpa、P.citriasiana、P.capitalensis和P.citrichinaensis。以遗传相似性系数0.97为阈值时,柑橘黑斑病病原菌(P.citricarpa)种群可分为5个亚类,subclade-I的菌株来自中国的本地早、温州蜜柑、槾橘和南丰蜜橘,subclade-II的菌株均来自中国的砂糖橘,subclade-III的菌株来自非洲莫桑比克柠檬和葡萄柚、佛罗里达甜橙、南非甜橙和来自杭州市场上进口的澳橘,subclade-IV的菌株来自中国的甜橙,subclade-V的菌株来自中国的柠檬,表明我国柑橘黑斑病病原菌具有丰富的遗传变异,其遗传变异与寄主相关;我国与国外的柑橘黑斑病病原菌在起源上可能存在差异。P.citriasiana、P.capitalensis和P.citrichinaensis种群内也存在遗传变异,但其遗传变异与地理分布和寄主未发现相关性。该研究结果为研究柑橘叶点霉属真菌的遗传多样性奠定了基础。