新型冠状病毒抗原检测胶体金法与核酸检测实时荧光RT-PCR方法比较

目的 对比分析新型冠状病毒抗原检测胶体金法与核酸检测实时荧光RT-PCR方法的检测结果,验证抗原检测胶体金法能否快速辅助诊断新型冠状病毒感染。方法 从河南省疾病预防控制中心生物资源库挑选2021年7-8月收集的新冠阳性和新冠阴性鼻拭子各60份,口咽拭子各30份,所有样本用实时荧光RT-PCR方法检测新冠核酸ORF1ab和N基因,用抗原检测胶体金法检测抗原,选择13份阳性样本进行10倍和100倍稀释,两种方法检测,分析胶体金法与核酸检测RT-PCR法检测结果的阳性和阴性一致率,进行统计学Kappa分析。结果 180份样本抗原检测胶体金法与核酸检测RT-PCR法的阳性符合率为98.89%,阴性符合率为100.00%,Kappa=0.989,13个样本10倍和100稀释后胶体金法阳性符合率分别为100%、84.61%。结论 新型冠状病毒抗原检测胶体金法可作为早期辅助确诊新型冠状病毒感染的快速方法。

荧光染料吖啶红作测定蛋白质的生物探针——蛋白质的染料分析法新进展

简述染料结合分析法的发展过程 ,吖啶红染料自聚体系测定蛋白质的最佳试验条件和测定结果。阳离子荧光染料吖啶红及其自聚的二聚体的可平衡转化 ,形成自聚平衡体系 ,在表面活性剂十二烷基磺酸钠的存在下 ,蛋白质的定量加入可调节这一平衡 ,从而引起体系荧光有规律的变化。方法线性范围宽、灵敏度高、反应速度快、准确度高、抗干扰能力强 ,是染料分析法定量测定蛋白质的最新方法之一。

染料示踪法联合荧光示踪法提高乳腺癌前哨淋巴结活检术成功率

背景近年来乳腺癌前哨淋巴结活检术(SLNB)愈来愈受到重视,而示踪剂的选择对于其成功率至关重要。目的评价染料示踪法联合荧光示踪法在乳腺癌SLNB中的临床有效性以及应用价值。方法选取2010年1月—2015年9月同济大学附属杨浦医院乳腺外科符合纳入标准的原发性浸润性乳腺癌患者449例为研究对象。采用随机数字表法将患者分成A组(226例,采用染料示踪法)和B组(223例,采用染料示踪法联合荧光示踪法)。收集患者一般资料〔包括年龄、体质指数(BMI)〕,计算各组患者SLNB成功率。将患者以BMI(≤22.5 kg/m2和>22.5 kg/m2)、年龄(≤55岁和>55岁)进行分层分析。结果 A组患者年龄、BMI小于B组(P<0.05)。223例BMI≤22.5kg/m2患者中,采用染料示踪法联合荧光示踪法SLNB成功率〔94.7%(108/114)〕高于采用染料示踪法〔78.0%(85/109)〕〔OR=5.082,95%CI(1.988,12.993)〕。226例BMI>22.5 kg/m2患者中,采用染料示踪法联合荧光示踪法SLNB成功率〔85.3%(93/109)〕高于采用染料示踪法〔63.2%(74/117)〕〔OR=3.378,95%CI(1.763,6.471)〕。不同BMI层之间同质(χ2BD=0.495,P=0.482)。去除BMI的混杂作用后,采用染料示踪法联合荧光示踪法SLNB成功率高于采用染料示踪法(χ2MH=25.979,P<0.001,ORMH=3.896)。244例≤55岁患者中,采用染料示踪法联合荧光示踪法SLNB成功率〔92.6%(112/121)〕高于采用染料示踪法〔75.4%(94/123)〕〔OR=3.928,95%CI(1.731,8.515)〕。205例>55岁患者中,采用染料示踪法联合荧光示踪法SLNB成功率〔87.3%(89/102)〕高于采用染料示踪法〔63.1%(65/103)〕〔OR=4.002,95%CI(1.975,8.111)〕。不同年龄层之间同质(χ2BD=0.006,P=0.939)。去除年龄的混杂作用后,采用染料示踪法联合荧光示踪法SLNB成功率高于采用染料示踪法(χ2MH=26.686,P<0.001,ORMH=3.928)。Logistic回归分析结果显示,示踪法、BMI、年龄是SLNB结果的影响因素(P<0.05)。Logistic回归模型分类预测准确率为80.2%。结论染料示踪法联合荧光示踪法可有效提高乳腺癌SLNB成功率,值得临床推荐使用。

罗丹明染料荧光猝灭法测定超痕量辣根过氧化物酶

在HAC-NaAC缓冲液中，辣根过氧化物酶催化H2O2氧化KI生成I2，过量的I^-可与I2结合形成I3，而I3^-分别与罗丹明S（RhS），罗丹明G（Rh6G），罗丹明B（RhB）和丁基罗丹明B（b-RhB）反应导致四体系在580，580，554和554nm处的荧光强度降低。在选择条件下，对于RhS，Rh6G，RhB，b-RhB四体系，辣根过氧化物酶的浓度分别在8～6400，40～4000，32～3200，40～6400Pg·mL^-1范围内与其荧光猝灭强度成线性关系，其检出限分别为3．2，3．0，2．4，3．7pg·mL^-1。其中RhS催化体系较好，用于酶联免疫乙肝试剂盒中辣根过氧化物酶活力的测定，结果比较满意。

建立染料法荧光定量PCR检测恙虫病东方体

目的建立染料法荧光定量PCR检测恙虫病东方体。方法根据恙虫病东方体56kD外膜蛋白基因序列设计特异性引物，建立染料法（SYBRgreenI）实时荧光定量PCR，评估其灵敏性及特异性；并对恙虫病东方体鸡胚培养物、东方体感染小白鼠脏器标本以及恙虫病病人血样等多种样本进行检测。结果建立的荧光定量PCR标准曲线的循环阈值（Ct）与模板拷贝数呈良好的线性关系（r2=0．99），灵敏性评估显示20¨l体系单PCR反应管靶基因大于28个拷贝即可被有效检测，最低检出浓度为2拷贝／¨l，比普通PCR检测方法提高1～2个数量级，并且具有较好的重复性；建立的SYBRI染料法具有良好的特异性，与立氏立克次体R株等其他5种立克次体，以及被检测的其他几种病原菌DNA模板均不发生特异性扩增；用建立的染料法对东方体鸡胚培养物、东方体感染动物脏器，以及采集的现场恙虫病病人血样共59份标本进行检测，其中57份检出阳性。用该定量PCR检测恙虫病东方体实验感染小鼠的血、脾脏、肾脏、肝脏标本，结果脾脏中东方体检出量最多，肝脏和肾脏次之，血中的恙虫病东方体量较低。结论本研究建立荧光定量PCR方法均具有很高的特异性和敏感性，适合各种样本中东方体的快速检测，可用于实验室的快速诊断。

猪血凝性脑脊髓炎病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速、准确、常规的猪血凝性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)检测方法,根据PHEV N蛋白基因序列,设计1对引物和1条探针,建立了PHEV实时荧光RT-PCR检测方法。该方法特异性好,与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪圆环病毒2型(PCV2)均无交叉反应;用阳性质粒Puc57-PHEVn评估其敏感性,发现检测下限达10-6 ng/μL(224拷贝/μL)。采集233份发病猪组织样品进行临床检测,发现该方法与巢式RT-PCR的符合率达98.3%,准确筛查出巢式RT-PCR并测序阳性的样品14份,且检出率高于巢式RT-PCR。结果表明,本方法敏感、特异,可用于PHEV临床样品的检测。

实时荧光RT-PCR与细胞培养法在流感病毒检测中的应用效果观察

目的分析研究实时荧光逆转录聚合酶链式反应RT-PCR和细胞培养法两种检测方法在流感病毒检测中的应用、及适合的领域。方法采集2014年10月至2015年3月国家级流感检测哨点医院抚顺市中心医院内科和儿科门诊病例咽拭子样本500份,同时采用实时荧光RT-PCR检测流感病毒核酸,以及采用MDCK进行阳性标本培养,分离流感病毒,比较两种方法的灵敏度以及差异性。结果在500份样本中,通过荧光RT-PCR检测阳性84份;通过MDCK细胞培养法阳性35份。二者之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。结论实施荧光RT-PCR在检测流感病毒时快速有效,更适合应急疫情的快速诊断。细胞培养法更适合核实疫情的实验室诊断,通过病毒抗原性和基因特性进行分析,是流感病原学检测的基础。

荧光定量聚合酶链反应染料法在HLA-B~★5801等位基因分析中的应用

目的:评估荧光定量聚合酶链反应(PCR)染料法在HLA-B*5801等位基因分析中的灵敏度、特异度、准确度和Kappa值,并与经典测序方法进行比较。方法:应用HLA-B*5801基因检测试剂盒对268例痛风、痛风性关节炎和高尿酸血症患者和50例正常人HLA-B*5801进行分析,并对318例标本HLA-B基因2、3、4外显子双向测序。结果:荧光定量PCR染料法敏感度、特异度和准确度均为100%,Kappa值为1。318例参与者HLA-B*5801等位基因发生率为9.2%(29/318)。痛风患者HLA-B*5801发生率8.51%(8/94),痛风性关节炎发生率9.52%(2/21),高尿酸血症发生率11.11%(17/153),正常人发生率4%(2/50)。结论:荧光定量PCR染料法能够快速准确检测HLA-B*5801,检测结果与测序方法完全一致。

近红外荧光法联合美蓝染料法在早期乳腺癌SLNB中的应用

目的探讨近红外荧光法联合美蓝染料法在早期乳腺癌前哨淋巴结活组织检查(SLNB)中的应用价值。方法应用近红外荧光法和美蓝染料法对141例临床腋窝淋巴结检查阴性的早期原发性乳腺癌患者行SLNB,记录单用近红外荧光法或美蓝染料法以及联合2种方法检出前哨淋巴结(SLN)的数目和检出率,比较联合法检出的SLN术中冰冻病理检查与术后石蜡病理检查结果,分析BMI对近红外荧光法检出SLN情况的影响。结果 141例中近红外荧光法检出SLN(2.78±1.28)枚/人,优于美蓝染料法检出的(2.29±1.31)枚/人(t=4.640,P<0.01),两者检出率比较差异有统计学意义(χ2=4.083,P=0.039);联合法检出SLN(3.11±1.30)枚/人,优于美蓝染料法(t=10.360,P<0.01),两者检出率比较差异有统计学意义(χ2=8.100,P=0.002)。联合法检出的140例SLN术中冰冻病理检查与术后石蜡病理检查阳性率比较差异无统计学意义(χ2=0.250,P=0.625)。BMI≥24 kg/m2者共86例(61.0%),近红外荧光法中共3例未测出发荧光的SLN,而BMI<24 kg/m2者的近红外荧光法SLN检出率为100%。结论近红外荧光法联合美蓝染料法可提高SLN的检出率和检出数目,提高SLNB的准确性,但如何提高肥胖患者的检出率是值得进一步研究的问题。

荧光RT-PCR法与病毒分离法检测NDV的研究

分别用荧光RT-PCR检测方法和病毒分离方法对364份不同样品进行NDV对比检测试验,结果运用RT-PCR方法可在4h内从364份样品中检出NDV阳性28份,而病毒分离方法检出NDV阳性29份,但需时间至少为21d。两种方法阳性重复率为100%。与病毒分离方法比较,荧光RT-PCR方法不仅可大大缩短检测时间,而且具有特异、敏感的特性。

荧光染料双染法观察汉防己对胸腺细胞的作用

目的观察防己(Radix Stephaniae Tetrandrae)对小鼠胸腺细胞增殖的影响。方法取昆明种小鼠的胸腺细胞,分为对照组和药物组,药物组用100μg/ml汉防己煎剂对胸腺细胞分别作用1h、6h、12h、24h后,采用DNA荧光染料双染法观察胸腺细胞增殖的影响。结果实验组可见典型凋亡细胞,对照组细胞大小比较均一,无明显形态学变化。随着药物作用时间的延长,凋亡小体的比例显著增加。结论防己可以诱导小鼠胸腺的细胞的凋亡。

猪瘟石门系强毒株SYBR Green-Ⅰ染料法实时荧光定量PCR方法的建立

为了能快速、准确地诊断猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)石门系强毒,根据登录在GenBank上23株Shimen毒株的全基因组序列,利用DNASIS软件进行序列分析,设计1对特异的荧光定量引物。建立猪瘟石门系强毒株SYBR Green-Ⅰ染料法实时荧光定量PCR快速检测方法。试验结果表明,本方法最低可检测到的Shimen病毒cDNA含量为100拷贝/μL,敏感度至少是普通PCR的100倍;猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、牛流行腹泻病毒Ⅰ型(BVDV-1)和猪瘟病毒C株均无特异性扩增,证明本方法具有很强的特异性;通过批内和批间重复试验,其变异系数<0.7%,结果显示本方法具有很好的重复性。本研究建立了猪瘟石门系强毒株SYBR Green-Ⅰ染料法实时荧光定量PCR快速检测方法,为猪瘟的预防与控制提供了有效的技术手段,并为猪瘟强毒试剂盒的研发奠定了基础。

猪流行性腹泻病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为快速、准确、灵敏检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV),以PEDV N基因为靶标设计引物,建立了一种PEDV SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。该方法最低可以检测到10个拷贝的病毒核酸,与猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪轮状病毒等胃肠道病毒均无交叉反应,批内、批间重复试验的变异系数均在2%以内,表明该方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。运用该方法对2018—2019年采集自山东省不同地区猪场的161份临床样品进行检测,检测结果与RT-PCR方法完全一致。以上结果说明,本试验所建立的SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR检测方法为PEDV的快速检测提供了良好工具和技术支持。

化学发光微粒子免疫检测法和实时荧光RT-PCR法检测甲型肝炎病毒的比较分析

目的:比较化学发光微粒子免疫检测法(CMIA)和实时荧光RT-PCR法对218份人血清中甲型肝炎病毒的检测结果.方法:选取2016年8月~2016年11月辽宁省丹东市传染病医院住院患者的血清样本218份,采用CMIA法和实时荧光RT-PCR法检测甲型肝炎病毒,同时对采用实时荧光RT-PCR法的ISO/TS15216-2、FDA-BAM、GB/T 22287-2008三个标准检测甲型肝炎病毒的引物和探针组合进行了比较分析.结果:化学发光微粒子免疫检测法的阳性检出例数为3例,其S/CO值分别为2.22、4.15、1.31.ISO/TS 15216-2、FDA-BAM、GB/T 22287-2008三种实时荧光RT-PCR法的阳性检出例数分别为7例、5例和4例.而CM IA法和实时荧光RT-PCR法有2个阳性样本的检测结果一致,测序的BLAST比对结果表明CM IA法1个阳性样本为假阳性结果,5个CMIA法阴性样本为假阴性结果.结论:ISO方法的实时荧光RT-PCR法用于人血清中甲型肝炎病毒的检测,准确度及灵敏度最佳.

三七染料法实时荧光聚合酶链式反应鉴别方法的建立

目的采用TB Green染料法实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术,基于叶绿体基因psbA-trnH序列建立鉴别三七的实时荧光PCR方法。方法通过比较三七及其同属的人参、西洋参和竹节参的psbA-trnH序列,设计出一对三七特异性引物,优化退火温度,进行灵敏度实验,并验证方法的特异性、适用性和抗干扰性,最后对市售三七样品进行检测。同时以18SrDNA引物为内参质控,对DNA提取及反应体系进行质控。结果所建立的三七染料法实时荧光PCR方法灵敏度为0.001 ng/μL;特异性较好,与18种近缘及常见中药材均无交叉反应;适用性和抗干扰性也较好;对28份不同加工方式的市售三七样品检测的结果与测序结果一致。结论建立的三七染料法实时荧光PCR方法具有快速、准确、灵敏的特点,可用于三七产品中三七成分的鉴别。

荧光染料双染流式法和萤火虫荧光素酶法检测CAR-T细胞杀伤的方法学研究

目的:比较荧光染料双染流式法和萤火虫荧光素酶法两种杀伤实验方法在嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptor-T,CAR-T)细胞针对不同性质靶细胞开展杀伤实验时的适用性。方法:针对两种不同性质的靶细胞(悬浮细胞和贴壁细胞),采用荧光染料双染流式法和萤火虫荧光素酶法开展CAR-T细胞的杀伤实验,比较实验结果的精确性和趋势的一致性。结果:荧光染料双染流式法在靶细胞为悬浮细胞的杀伤实验中能检测到具有统计意义的显著杀伤(P<0.01),但在靶细胞为贴壁细胞的实验中差异不显著;萤火虫荧光素酶法在悬浮和贴壁两种靶细胞的杀伤实验中都能检测到显著的杀伤(P<0.01)。结论:荧光染料双染流式法更适合靶细胞为悬浮细胞的杀伤实验,而萤火虫荧光素酶法对悬浮细胞和贴壁细胞都适合,因此在具体应用过程中应注意区别对待。

荧光定量PCR染料法检测强直性脊柱炎患者HLA-B27基因及分型

目的探讨荧光定量PCR染料法检测强直性脊柱炎(AS)患者人类白细胞抗原B27(HLA-B27)基因及亚型的临床应用价值。方法收集2014年1月至2015年3月深圳市福田区风湿病专科医院已确诊的强直性脊柱炎患者血液标本43例和体检健康者血液标本56例,采用流式细胞法检测HLA-B27基因,同时采用荧光定量PCR染料法检测HLA-B27基因及分型。结果流式细胞法检测43例AS患者中40例阳性(93.02%),荧光定量PCR染料法检测39例阳性(90.70%),两者符合率为97.50%。39例HLA-B27者中B2704亚型者有32例(82.05%),B2705亚型者有7例(17.95%)。结论荧光定量PCR染料法检测HLAB27基因准确率高,与流式细胞法有高度一致性,同时还能检测HLA-B27基因亚型,具有很好的临床推广价值和应用前景。

实时荧光定量RT-PCR法检测2012—2013年常熟市突发公共卫生事件致病原

目的了解常熟市突发公共卫生事件事件致病原,为处置提供实验室依据。方法运用实时荧光定量RT-PCR法,对突发公共卫生事件中采集的相关标本,分别进行诺如病毒(NV)、手足口病相关肠道病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒核酸检测。结果 2012-2013年,常熟市共报告14起突发公共卫生事件,采集96份标本;11起突发公共卫生事件确认了致病原,占78.6%;50份标本检出相关病毒,阳性率52.1%。其中10起急性肠胃炎事件采集84份标本,41份检出诺如病毒Ⅱ型(GⅡ),阳性率为48.8%;1起群体性发热事件采集5份标本,2份检出甲型流感病毒,阳性率为40.0%;3起群体性幼儿手足口病事件采集7份标本,均为肠道病毒核酸通用阳性(100.0%),4份为CoxA16(占57.1%)。肛拭子、咽拭子标本阳性率较高。结论实时荧光定量RT-PCR检测技术,可快速确定突发公共卫生事件的致病原。

ELISA法和荧光定量RT-PCR在登革热病毒感染早期检测中的差异对比

目的:比较ELISA法和荧光定量RT-PCR在登革病毒感染早期检测中的差异,提高早期筛查效率。方法:收集2016年1月-2018年12月广东省佛山市地区疑似登革热且发病7 d内的病例的血清标本3780份,均采用ELISA法(登革热病毒NS1抗原检测)及荧光定量RT-PCR(病毒核酸检测)进行检测,比较两种检测方法的差异。结果:在病程第2~5天,ELISA法检测的阳性率低于荧光定量RT-PCR检测,差异有统计学意义(P<0.05)。在病程第6~7天荧光定量RT-PCR检测的阳性率低于ELISA法检测,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:对于疑似登革热病例早期筛查,发病2~5 d可先行荧光定量RT-PCR检测,对于发病6~7 d可先行ELISA法检测,以提高筛查效率。

不同的核酸提取方法在布鲁氏菌检测中的应用评价

目的比较不同核酸提取方法对布鲁氏菌检出率的影响,为布鲁氏菌核酸快速提取检测提供技术参考。方法分别使用磁珠法、直接裂解法和高温裂解法对感染布鲁氏菌患者的20例全血样本、10例关节腔及浆膜腔积液样本进行核酸提取,然后进行实时荧光RT-PCR检测,采用SPSS 22.0对结果进行统计分析,评价该核酸快速提取试剂的DNA提取效率。结果磁珠法阳性检出率为100%,Ct值中位数为29.17(21.19~31.33),批内变异系数(CV)最高为1.33%。直接裂解法阳性检出率为63.33%,Ct值中位数为33.29(28.69~34.54),批内CV最高为1.28%。高温裂解法阳性检出率为100%,Ct值中位数为30.26(26.63~33.85),批内CV最高为1.21%。高温裂解法和磁珠法检出率比较差异无统计学意义(P>0.05),直接裂解法检出率显著低于磁珠法和高温裂解法(P<0.05)。结论核酸快速提取试剂在高温裂解条件下可保证核酸提取效率和重复性稳定,具有操作简单、检测时间短、降低实验室生物安全风险等优势,可以应用于布鲁氏菌的核酸检测。